液可以简单地由溶解在 水中的HA底物组成。在优选的实施方案中，在开始交联步骤中的溶液具有9或更高的pH，例 如10或更高的pH，或甚至11且更高的pH。
[0129] 总体而言，开始交联步骤可以采用任何浓度的HA和交联剂来进行，并且时间和温 度可以变化，只要HA的开始交联实现并且有剩余的反应性交联剂共价附接至HA。
[0130] 开始交联步骤通常在10-75°C的温度进行，但优选的是该步骤在室温例如20_25°C 进行。其他优选的温度范围是l〇_55°C，例如18-35°C和35-55°C。
[0131] 开始交联步骤的水溶液包含是多官能的一种或更多种交联剂，即具有用于与正被 交联的HA分子形成共价键的两个或更多个反应位点。优选的是在此第三步骤中使用的交联 剂是双官能的，即它具有用于与正被交联的HA分子形成共价键的两个反应位点。不受限于 那些，有用的多官能交联剂包括二乙烯砜、多环氧化合物和双环氧化合物，例如1，4_ 丁二醇 二缩水甘油醚(BDDE)、1，2_乙二醇二缩水甘油醚(EDDE)和二环氧辛烷，优选地BDDE。合意的 是一种或更多种多官能交联剂提供醚交联。
[0132] 开始交联步骤还可以包括，或随后是，获得的活化的HA的合意形状的制备，例如颗 粒、纤维、绳、线、网、膜、圆盘和珠。这可以以多种方式来完成，例如挤压、切碎和模制。HA底 物的挤压通常包括将它压制通过合意大小的开口。纤维、绳或线的尺寸例如厚度可以通过 改变开口的尺寸或类型例如使用在〇. l_2mm或14-30G的范围内的各种开口直径、挤压压力、 挤压速度和/或HA浓度来控制。通过使用其他类型的孔和裂口，不同形状或结构可以被产 生。可选择地，合意大小的颗粒或珠可以通过将活化的HA的凝胶切碎来制备，例如通过将活 化的HA压制通过具有合意的筛孔(开口）大小的筛材料。HA还可以以多种形式被模制，例如 膜、网、圆盘或珠。
[0133] 此形状可以遍及制造方法和在最终产物中被保持。优选的是，当HA底物是以溶胀 形式在生理盐水中时，该形状具有小于5mm、优选地小于1mm，并且大于0.5mm或甚至大于 0.8mm的延伸。优选的形状是具有当完全溶胀于生理盐水中时0.1-5. Omm例如0.5-lmm的大 小的颗粒或珠。在纤维、绳、线、网和膜的情况下，在一个或两个尺寸上分别地显著大于5mm 的尺寸可以是可应用的。
[0134] 开始交联和任选的成型之后是交联剂除去步骤。此步骤包括将未反应的交联剂从 活化的HA中除去。如以上所陈述的，从开始交联步骤中获得的活化的HA包含交联的HA分子 和被展示反应性交联功能的交联剂取代的HA的混合物。在开始交联步骤之后，还有未共价 偶合至HA的交联剂的明显存在，因为它完全未反应，或者因为它与水分子或与含水介质的 其他组分例如氯离子反应。未反应的交联剂，即未被共价偶合至HA的交联剂，在此步骤中通 过任何合适的方式例如渗析和洗涤被除去，包括，例如过滤、倾析和/或离心。不言而喻，在 此步骤中不添加交联剂。
[0135] 在优选的实施方案中，与未反应的交联剂有关的活化的HA在当未反应的交联剂被 除去之前或同时被沉淀在液体沉淀介质中。
[0136] 活化的HA由于HA的溶解度的降低而被沉淀。这通常通过使活化的HA经受液体介质 来实现，在该液体介质中它是不溶的。如技术人员很好的意识到，这可以通过将活化的HA添 加至沉淀介质，通过将沉淀介质添加至活化的HA，或通过其他合适的方法步骤来实现。液体 沉淀介质包含一定量的给出HA沉淀条件的一种或更多种水溶性有机溶剂。获得的固体HA沉 淀物落在溶质相之外，并且可以通常通过过滤、倾析、离心、或手动地使用一对镊子或类似 物从剩余的液体中被分离。获得的悬浮液包含液体沉淀介质和沉淀形式的活化的HA。未反 应的交联剂的洗去通过任何合适的方式，例如渗析和洗涤，包括例如过滤、倾析和/或离心。 优选的是，未反应的交联剂通过用液体沉淀介质（代表性地用于沉淀活化的HA的相同类型 的液体沉淀介质）洗涤沉淀的、活化的HA而从沉淀的、活化的HA的悬浮液中被除去。从沉淀 形式的活化的HA中除去交联剂是有利的，因为它迅速产生非常清洁的中间体产物，即不留 下未反应的交联剂。此交联剂除去步骤在大规模工艺中也是非常有用的。
[0137] HA或HA凝胶可以是以溶解的或溶胀的凝胶形式或以沉淀的形式，取决于它存在于 其中的液体介质。
[0138] 在良好的HA溶剂中，即在HA和溶剂之间的相互作用比HA分子自身之间的相互作用 在能量上有利的溶剂中，HA或HA凝胶将是以溶解的或溶胀的凝胶形式。良好的HA溶剂的一 个实例是水。
[0139] 在差的HA溶剂或HA非溶剂中，即在HA分子自身之间的相互作用比HA和溶剂之间的 相互作用在能量上有利的溶剂中，HA或HA凝胶将是以沉淀的形式。差的HA溶剂的一个实例 是乙醇。
[0140] 如本文所使用的，术语"液体沉淀介质"指的是一种液体介质，在该液体介质中活 化的HA当被沉浸时将在沉淀物中。换句话说，液体沉淀介质是用于活化的HA的非溶剂。
[0141] 液体沉淀介质通常包含大于50wt%例如大于65wt%的溶解在水中的水溶性有机 溶剂，和任选的另外的成分例如盐、缓冲剂、碱和酸。水溶性有机溶剂将以足以实现活化的 HA的沉淀的浓度存在，但不一定过量存在。在优选的实施方案中，液体沉淀介质包括或包含 大于50wt %的水溶性有机溶剂和多达50wt %的水，并且优选地60-90wt %或65-85wt %的水 溶性有机溶剂和l〇_40wt %或15-35wt%的水。在特定的实施方案中，液体沉淀介质包含，大 于60wt%、优选地60-90wt%或65-85wt%的水溶性有机溶剂，另外的成分例如盐、缓冲剂、 碱和酸，以及水，总计IOOwt %。
[0142] 根据本发明使用的有机溶剂是含碳溶剂并且可以展示不同程度的极性。尽管被称 为"溶剂"，然而应理解，这些有机溶剂用于在制造方法期间平衡和改变HA的溶解度。HA可以 非常好地被溶解在以某种有机溶剂浓度区间的有机溶剂中，但当有机溶剂浓度被提高时， HA沉降并且形成沉淀物。例如，HA可以被溶解在有机溶剂（例如低级烷基醇）和水的50/50 (wt/wt)混合物中，但在90/10(wt/wt)混合物中沉降并且形成沉淀物。当经受非沉淀条件例 如50/50或0/100混合物时，HA回至非沉淀的、溶解的状态。技术人员很好地意识到，其他因 素可以影响用于HA沉淀的限制的有机溶剂浓度，例如温度、pH、离子强度和有机溶剂的类 型。在给定的条件下用于HA沉淀的限制的浓度是本领域技术人员熟知的或可以容易地被本 领域技术人员确定。通过实例的方式，用于HA沉淀的限制的浓度(在水和乙醇的混合物中） 是大约65wt%的乙醇。
[0143] 不被那些限制，根据本发明的有机溶剂可以选自由以下组成的组:戊烷、己烷、环 己烷、1，4_二氧六环、N，N_二甲基甲酰胺、N，N_二甲基乙酰胺、乙酸乙酯、乙酰胺、乙醚、四氢 呋喃、乙腈、甲基乙基酮、丙酮、低级烷基醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇。根据本发 明的有机溶剂是水溶性的。有机溶剂的优选的组是低级烷基醇。术语低级烷基醇包括具有 一个至六个碳原子的伯、仲和叔烷基醇，即烷基醇。低级烷基醇的特定的实例包括甲醇、 乙醇、变性酒精、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、和叔丁醇。优选的低级烷基醇是甲醇和乙 醇，特别地乙醇，由于价格、可得性和易处理。
[0144] 交联剂除去步骤还可以包括，或随后是，获得的活化的HA的合意形状的制备，例如 颗粒、纤维、绳、线、网、膜、圆盘和珠。优选的是，活化的HA的合意形状的制备发生在步骤中 在将未反应的交联剂从活化的HA中实际除去之前。因此，合意形状的制备可以优选地发生 在活化的HA的任何沉淀之前。
[0145] 合意形状的制备可以以多种方式来完成，例如挤压、切碎和模制。HA底物的挤压通 常包括将它压制通过合意大小的开口。纤维、绳或线的尺寸例如厚度可以通过改变开口的 尺寸或类型例如使用在〇.l_2mm或14-30G的范围内的各种开口直径、挤压压力、挤压速度 和/或HA浓度来控制。通过使用其他类型的孔和裂口，不同形状或结构可以被产生。可选择 地，合意大小的颗粒或珠可以通过将活化的HA的凝胶切碎来制备，例如通过将活化的HA压 制通过具有合意的筛孔(开口）大小的筛材料。HA还可以以多种形式被模制，例如膜、网、圆 盘或珠。
[0146] 此形状可以遍及制造方法和在最终产物中被保持。在某些优选的实施方案中，当 HA底物是以溶胀形式在生理盐水中时，该形状具有小于5mm、优选地小于1mm，并且大于 0.5mm或甚至大于0.8mm的延伸。优选的形状是具有当完全被溶胀于生理盐水中时0.1-5 · Omm例如0 · 2-3 · Omm或0 · 5-lmm的大小的颗粒或珠。在某些其它的优选实施方案中，当HA底 物是以溶胀形式在生理盐水中时，形状在至少一个尺寸上具有大于5mm或显著大于5mm的延 伸。优选的形状是具有若干厘米例如1-100厘米的长度的纤维、绳或线。优选的是，在其长度 与其宽度或其平均直径之间的比是5:1或更高，例如100:1或更高，并且任选地10000:1或更 低，例如2500:1或更低。
[0147] 交联剂除去和任选的成型之后是最终或完成交联步骤。在此方法步骤中，活化的 HA底物的交联被完成。在开始交联步骤中已经被共价附接至HA的交联剂中的剩余的反应性 基团与活化的HA上的另外的可行的位点反应以实现另外的交联，即（至少)两个分开的HA分 子之间或同一 HA分子的两个远离部分之间的共价偶合。可优选的是，在开始交联步骤中获 得的活化的HA的合意形状在此完成交联步骤之前被制备。
[0148] 尽管此步骤完成HA的交联，然而应注意在此步骤中没有游离的或未结合的交联剂 存在。来自开始交联步骤的任何剩余的未结合的交联剂已经在交联剂除去步骤中被除去。 由此，交联剂应不添加在此步骤中，或者不添加在开始交联步骤或交联剂除去步骤之后的 任何步骤中。尽管最终交联的HA产物可以被加工成不同形状，然而优选的是活化的HA在最 终交联步骤之前已经被加工成合意的形状。
[0149] 活化的HA交联成交联的HA产物是通过使活化的HA经受另外的交联条件来完成。完 成交联步骤在液体沉淀介质和沉淀形式的活化的HA的悬浮液中进行。认为这改进了有效交 联剂比（CrR)，即已经结合两个(或更多个)二糖(仅HA-X-HA)的总结合的交联剂(HA-X-HA和 HA-X)的比例。不期望被任何具体理论所束缚，这可能是首先由于使得HA链彼此更接近并且 其次由于在沉淀的HA网络内竞争的水分子的局部缺乏。在沉淀形式的活化的HA的悬浮液中 进行完成交联步骤还限制了副反应，例如与周围沉淀介质和卤化物离子的副反应。在此步 骤中没有另外的交联剂被添加。
[0150] 完成交联意指一旦引入交联条件就会在沉淀形式的活化的HA的悬浮液中发生的 交联。交联条件意指，在其下，展示反应性功能的交联剂将与活化的HA上可行的位点反应以 实现另外的交联的条件。
[0151] 术语最终(final)或完成(finalizing)被用以将该第二交联步骤与第一、开始交 联步骤区分。完成交联提高了已经结合两个(或更多个)二糖(仅HA-X-HA)的总结合的交联 剂(HA-X-HA和HA-X)的比例。
[0152] 如以上所陈述的，活化的HA可以在当未反应的交联剂被除去之前或同时在液体沉 淀介质中被沉淀。可选择地，活化的HA在液体沉淀介质中的沉淀在未反应的交联剂的除去 之后，例如在使活化的HA在最终交联步骤中经受另外的交联条件之前进行。因此，最终交联 步骤可以包括，使活化的HA在液体沉淀介质中沉淀以获得包含液体沉淀介质和沉淀形式的 活化的HA的悬浮液；以及通过使沉淀的、活化的HA的悬浮液经受另外的交联条件来完成活 化的HA的交联。再者，在此步骤中没有另外的交联剂被添加。
[0153] 在优选的实施方案中，在完成交联步骤中的悬浮液具有9或更高的pH，例如10或更 高的pH、ll或更高的pH、或者甚至12且更高的pH。
[0154] 完成交联步骤通常在10_75°C的温度进行，但优选的是该步骤在室温例如20_25°C 进行。优选的温度范围是10_50°C，例如18-40°C。
[0155] 根据本发明的方法还可以包括一个或更多个另外的步骤。优选的方法步骤包括使 来自完成交联步骤的沉淀的、交联的HA产物经受非沉淀条件。这通常包括使交联的HA产物 经受液体介质并且允许它回至非沉淀的状态。液体介质通常是水、盐水、或其混合物和/或 其组合，任选地具有非沉淀浓度的有机溶剂例如甲醇或乙醇。
[0156] 由于交联，获得的HA产物是互联的且缠绕的HA链的连续网络，其在非沉淀条件下 吸收液体(溶胀)并且形成凝胶。溶胀可以被允许进行直到凝胶完全被溶胀并且没有另外的 液体可以被吸收，或它可以在较早阶段被中断以获得部分溶胀的凝胶。部分溶胀的凝胶可 以被用作用于凝胶的进一步加工的中间体，例如具有合意的大小和形状的凝胶结构的进一 步的机械生产可以被进行。通过实例的方式，膜可以被切割成颗粒、切片或块，凝胶纤维可 以被切割成较短的片段，很好地界定的不规则的形状可以从膜等等中被设计。交