miR-34活性的生物标志物的制作方法
【专利说明】m i R-34活性的生物标志物 相关申请的交叉引用
[0001 ] 本申请要求提交于2013年6月24日的USSN 61/838,847和提交于2013年8月28日的 USSN 61/870，997的优先权的权益，其内容通过引用整体并入本文。 美国政府的权利
[0002] 本发明是在国立卫生研究院第1R43CA134071和1R43CA137939号基金支持下进行 的工作中作出的。美国政府可拥有本发明的权利。 序列表
[0003] 本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式提交并且通过引用整 体并入本文。所述ASCII拷贝创建于6月23日，被命名为"112172-242 Sequence Listing TEXT"并且为30，360字节。
技术领域
[0004] 本发明总体上涉及癌症疗法，并且更具体地，其涉及在疾病治疗、诊断、预后和/或 疾病进展的评估中涉及诸如miR-34的mi Cr〇RNA(miRNA)分子的方法和组合物。
【背景技术】
[0005] microRNA-34(miR-34)是一种强肿瘤抑制物，其在许多实体和血液癌症类型中显 不功能的丧失（Lodygin等人，Cell Cycle 7(16):2591-600(2008);Gallardo等人， Carcinogenesis 30( 11): 1903-9(2009) ;Chim等人，Carcinogenesis 31:745-750(2010))。 可能是通过阻抑控制增殖、衰老、凋亡和转移的过多的癌基因，microRNA-34抑制广泛范围 的癌细胞（Hermeking,Cell Death Differ 17(2) :193-9(2010) ;Bader,Front Genet 3 (120)(2012))可能还干扰癌干细胞的生长(Ji等人，PLoS 0ne，4(8):e6816(2009); Liu等人，Nat Med 17(2) :211-5(2011)),这为开发miR-34疗法提供了强大的基本原理。 miR-34的治疗应用的证据已经在肺、肝、前列腺和淋巴瘤的鼠肿瘤模型中产生，它们显示出 响应于负载有合成miR-34模拟物的纳米颗粒的全身递送的强烈肿瘤抑制（Bader ,Front Genet 3(120)(2012);Liu等人，Nat Med 17(2):211-5(2011);Trang等人，Mol Ther 19
[6] : 1116-22(2011) ;Wiggins等人，Cancer Res 70(14) :5923-30(2010);Craig等人， Leukemia(2012))。基于miR-34的疗法目前处于I期临床试验中。
[0006] 近来的报道已经增加了对miR-34的作用的更深入的了解，所述报道证明了肿瘤抑 制物TP53(p53)转录诱导了全部三个miR-34家族成员miR-34a/b/c的表达(Bommer等人， Curr Biol, 17(15):1298307(2007);Chang等人，Mol Cell 26(5):74552(2007);He等人， Nature 447(7148) :11304(2007) ;Raver Shapira等人，Mol Cell 26(5):73143(2007); Tarasov 等人，Cell Cycle 6(13) :158693(2007)) JP53 还提高了miR-215、miR-192 和 miR-194的内源性水平，这三种均具有在培养中抑制癌细胞生长的能力(Braun等人,Cancer Res 68(24): 10094-104(2008) !Georges等人，Cancer Res 68(24): 10105-12(2008) ;Pichiorri 等人，Cancer Cell 18(4):367-81(2011))。尽管1^1?-215和11^1?-192在单独的基因组基因座 上编码，但它们共享相同的种子序列（90.5%的总体序列同源性）并因此可被总称为miR-215/192。对于一些miRNA，TP53与miRNA之间的正调控是相互的--miR-215/192通过阻抑 MDM2(也被称为HDM2)来刺激TP53活性，MDM2是通过蛋白酶体降解来负调控TP53稳定性的泛 蛋白连接酶（Pichiorri等人，Cancer Cell 18(4) :367-81(2011) ;Momand等人，Cell 69 (7) :1237-45( 1992) ;01iner等人，Nature 358(6831) :80-3( 1992))。类似于miR-215/192， 通过阻抑使TP53失活的NAD依赖性脱乙酰酶SIRTl(沉默信息调控因子I)、编码负调控TP53 反式激活的MDM2样蛋白质的MDM4和编码与TP53DNA结合位点的子集结合的转录因子的YY1， miR_34a在对TP53的正反馈回路中起作用（Yamakuchi等人，Proc Natl Acad Sci U S A 105(36): 13421-6(2008) ;Mandke等人，PLoS One 7(8) :e42034(2012))。因此，TP53对于 miR-34诱导的表型可能是功能性需求。
[0007] 鉴于TP53在癌症中的高突变率，该先决条件实质上将限制基于miR-34的疗法应用 于具有完整TP53的患者。尽管可用数据支持了TP53增强miR-215/192的抑制活性的观点 (Pichiorri等人,Cancer Cell 18(4):367-81 (2011 ))，但在miR-34诱导的肿瘤抑制中对于 TP53的需求是有争议的，并且TP53的实际贡献是未知的。
[0008] 因此，尽管microRNA在多种癌症的诊断和治疗中的应用已经取得了重大进展，但 特定的microRNA疗法可能在某些亚群中没有效果或效果不大。在某些亚群中需要更好的解 决方案，例如，在TP53缺陷的细胞或癌症类型中。预测患者是否对特定疗法有反应或快速确 定该患者是否对特定疗法发生反应的能力可减少与癌症治疗相关的时间和成本，同时提供 更好的结果。
【发明内容】
[0009] 本发明至少部分地基于以下发现:miR-34的功能不依赖于P53。已发现miR-34在不 依赖于TP53的肿瘤抑制途径中起作用。具体地，发现癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53 正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。因此，miR-34在未与p53耦合的肿瘤抑制过程中具有 更主要的作用。在不存在p53的情况下，不同于某些其他的miRNA，miR-34足以诱导已知被 P53调控的基因的上调，该基因包括但不限于P21waf1/gip1(CDKN1A)、PUMA、BAX、N0XA、PHLDA3 和MDM2，并且诱导HDAC1的下调。因此，本发明认为这些生物标志物可用作mi R-34活性的生 物标志物。在各种实施方案中，先决生物标志物是DNA、mRNA或蛋白质(或其组合）。在先决生 物标志物是DNA时，它可以是非沉默的和没有任何失活突变的基因的DNA。本发明还基于以 下发现：这些生物标志物中的某些对于对miR-34活性的治疗响应是不可或缺的，因此是 miR-34活性的先决生物标志物。 治疗方法
[0010] 在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法。提供了两类总的治疗 方法。第一组方法包括筛选步骤，该筛选步骤采用miR-34活性的一种或多种先决生物标志 物来确定miR-34疗法对于受试者是否为合适的治疗方法。第二组方法包括测定在受试者中 miR-34活性的生物标志物的相对水平以确定受试者对通过miR-34治疗剂治疗的响应。
[0011] 在一些实施方案中，第一组提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括： (a) 针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者； (b) 如果确定存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用miR-34治疗剂；以 及 (C)如果不存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用供替代的疗法， 从而治疗该受试者。所述至少一种先决生物标志物可选自p21QP1/WAF1、PUMA、BAX、N0XA、 PHLDA3、MDM2和HDACl。在一些方面，所述至少一种先决生物标志物包括p21GIP1/WAF1，而在一 些方面，筛选受试者所针对的唯一的先决生物标志物为p21 eiPVwAF1。例如，所述至少一种先 决生物标志物可选自？21^1/_1、？1]麻、84乂、1^(^、？!11^3和1?观2，并且所述至少一种先决生 物标志物的存在包括等于或高于参考水平的表达水平或活性水平。在另一实例中，所述至 少一种先决生物标志物是HDACl，并且所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或低 于参考水平的表达水平或活性水平。
[0012]在一些实施方案中，第二组提供了确定用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法 的响应的方法，所述方法包括： (a) 测定该受试者中miR-34活性的至少一种生物标志物的第一水平； (b) 向该受试者施用miR-34治疗剂； (c) 测定该受试者中该生物标志物的第二水平； (d) 如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效，则进一步向该受试 者施用miR-34治疗剂；以及 (e) 如果相对于第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效不足，则向该受试者 施用供替代的疗法， 从而确定该受试者对癌症疗法的响应并提供合适的治疗。该生物标志物可选自 1)21'1/窗1、1)53、131]獻、以)(、购 )^、13乩1^3、]^腫2和| 11^(：1。在一些方面，步骤卬）和（(1)中的 miR-34治疗剂是相同的。
[0013] 受试者可患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺 癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。在一些方面，已经确定受试者具有p21 QP1/WAF1阳性 癌细胞。例如，可确定受试者具有p21eiPVwAF1阳性癌细胞和p53缺陷的癌细胞。例如，可确定 受试者具有含有 P21eipi/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/-)基因和杂合失活的（-/-)P53基因的癌 细胞。在另一实例中，可确定受试者具有含有p21 QP1/WAF1野生型(+/+)或杂合(+/_)基因且缺 乏功能性P53蛋白质的癌细胞。在另一实例中，可确定受试者具有功能性p21 QP1/WAF1蛋白质 和非功能性或缺失P53蛋白质。受试者可患有血液系统恶性肿瘤，例如，白血病(急性淋巴母 细胞白血病（ALL)、急性髓性白血病（AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病 (CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)或其 他白血病）；淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤(全部四种亚型）、滤泡性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或非霍奇 金淋巴瘤(全部亚型））；骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤）；或骨髓发育不良综合征。
[0014] miR-34治疗剂可包括miR-34并且还可任选包括miR-215和miR-192中的至少一种。 miR-34可以是miR-34a、b或c，或miR-449a、b或c。施用miR-34治疗剂之后细胞增殖的水平可 能下降。施用miR-34治疗剂之后肿瘤大小或进展可能下降或减慢。
[0015] 在一些方面，供替代的疗法可以是非miR-34的microRNA疗法或非microRNA疗法。 例如，供替代的疗法可选自中断的疗法、化学疗法、放射疗法、手术、姑息疗法、miR-215和 miR-192。供替代的疗法可以是非miR-34的microRNA疗法和非microRNA疗法的任何组合。例 如，供替代的疗法可包括miR-215和miR-192中的至少一种。
【附图说明】
[0016] 图1显示TP53和miR-34的共同的和各自的肿瘤抑制途径。
[0017] 图2A-2E显示在同基因癌细胞系中诱导TP53基因之后的内源性mRNA和miRNA水平。 TP53 的 mNRA 水平相对于 TP53+/-细胞（SW48、HCT116、RK0)或 TP53-Λ 细胞(MCF10A;表达=1)中 的水平进行归一化。来自DLD-I细胞的数据相对于DLD-Ivsr细胞进行归一化。全部其他数据 相对于ΤΡ53缺陷的细胞中的表达水平相对表达=1)进行归一化。显示了平均值和标 准差。η，未检测;*，由于不存在于参考细胞中，数据相对于标准化的PCR阈值进行归一化。
[0018] 图3A-3D显示了在同基因癌细胞系中miR-34a对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模 拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
[0019] 图4A-4D显示了在同基因癌细胞系中miR-34c对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模 拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
[0020] 图5A-5D显示了在同基因癌细胞系中miR-215对癌细胞增殖的抑制。数据相对于模 拟转染的细胞进行归一化。显示了平均值、标准差和非线性回归趋势线。
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