(0MIM#191170)(SEQ ID N0:10)、 PUMA(0MIM#605854)(SEQ ID NO:11)^BAX(0MIM#600040)(SEQ ID NO:12)^NOXA(OMIM# 604959)(SEQ ID NO:13)、PHLDA3(OM頂#607054)(SEQ ID NO:14)、MDM2(OM頂#164785)(SEQ IDN0:15)和HDAC1(0MIM#601241)(SEQIDN0:16)。这些生物标志物和它们的序列表的实 例在美国专利申请公开号2008/0274956、2010/0292085和2009/0298054和WO 2000/075184 中讨论，其全部通过引用并入本文。
[0067] miR-34活性的先决生物标志物是这样的生物标志物，如果不存在则使得受试者不 响应于miR-34疗法，即，对miR-34的响应的生物标志物。miR-34活性的一些生物标志物，例 如p21GIP1/WAF1(⑶KN1A)，是miR-34活性的先决生物标志物，而miR-34活性的其他生物标志 物，例如P53,不是miR-34活性所必需的。例如，miR-34活性的生物标志物可表明，miR-34在 受试者中是活性的，尽管如此，如果不存在miR-34活性的先决生物标志物，则可能在该受试 者中不具有治疗益处。miR-34活性的先决生物标志物可包括但不限于p21 eiPVwAF1(CDKNlA)、 卩1]]\^、84乂、勵乂4、？!10^3、]\?^2和肋4(：1。如果表达水平或活性水平等于或高于参考水平，则 确定存在该生物标志物，否则确定不存在该生物标志物。参考水平可根据细胞类型或受试 者而变化。例如，该参考水平可以是通过特定的测定可检测到的最低水平。例如，该参考水 平可以等于生物标志物在受试者中的表达或活性或在其正常范围之内。例如，如果表达水 平或活性水平在参考水平的 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20 %、25 %、30 %、33 %、 40 %、50 %、60 %、70 %、75 %、80 %或90 %之内，则可确定存在生物标志物。
[0068] 如果在生物标志物表达或活性的第一水平与生物标志物表达或活性的第二水平 之间有相对变化，则生物标志物可指示出miR-34治疗剂的功效。第一水平与第二水平之间 的相对变化为至少3%、4%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、 80%、90%、95%、99%或100%可指示出miR-34治疗剂的功效。根据生物标志物，第二水平 可以高于或低于第一水平以指示功效。例如，miR-34活性的生物标志物的第二水平可以比 第一水平至少高50%，预期该生物标志物响应于miR-34治疗剂如p21而上升。在其他一些实 例中，miR-34活性的生物标志物的第二水平可以比第一水平至少低50%，预期该生物标志 物响应于miR-34治疗剂如HDACl而下降。 p2^CIpi/ffAF1
[0069] 人p21GIPVwAF1定位于染色体6p21.2的基因⑶KNlA上，该基因编码细胞周期蛋白依 赖性激酶(CDK)抑制剂。1922年首次描述了蛋白质p21 QPVwAF1(Xiong等人，Cell 71:505-514 (1992)) WIqpvwafi是另外已知被p53转录调控的强肿瘤抑制物，并且是p53响应所必需的。 p21QP1/WAF1的主要功能包括通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(⑶K)而阻滞细胞周期和通 过与增殖细胞的核抗原（PCNA)结合而阻断DNA合成(Abbas等人,Nat Rev Cancer 9(6): 400-14(2009))。然而，p21QP1/WAF1还可以抑制其他的致癌途径，包括通过WNT4、STAT3、MYC和 TERT调控的途径(Abbas等人，Nat Rev Cancer 9(6) :400-14(2009))。
[0070] p21GIP1/WAF1 属于 CKI 的 Cip/Kip 家族(p21GIP1/WAF1、p27KIP1 和 p57KIP2)，这些 CKI 参与细 胞周期蛋白/CDK复合物的活性调控并且已经显示通过抑制CDK负调控细胞周期蛋白介导的 细胞周期进程(美国专利申请公开号2005/043262) WIqpvwafi的改变可对细胞增殖的调控 有不良影响并且增加癌症的易感性。已经在多种人类癌症中观察到p21 QP1/WAF1多态性。
[0071] P21eipl/WAF1阳性癌细胞是具有功能性p21eipl/WAF1的可检测的表达水平或活性水平 的癌细胞。例如，p21eiPVwAF1阳性癌细胞可以是具有野生型p21QP1/WAF1活性或表达水平的癌 细胞。例如，可以通过测量细胞增殖或通过使用针对p21GIPVwAF1的siRNA来检测p21GIP1/WAF1活 性水平。 p53
[0072] 如以上所讨论的，肿瘤抑制物TP53(p53)转录诱导全部三个miR-34家族的表达，但 在癌症中具有高突变率。P53正常的癌细胞具有p53野生型表达和活性。p53缺陷的癌细胞具 有低于P53正常的细胞的表达水平和/或活性水平。具有杂合的或纯合的TP53突变的癌细胞 是p53缺陷的癌细胞。例如，具有显性阴性突变的细胞是p53缺陷的癌细胞。在一些实施方案 中，P53缺陷的癌细胞不具有任何内源性p53。在一些实施方案中，p53缺陷的癌细胞不具有 功能性P53。肺癌(非小细胞肺癌(NSCLC)，例如，腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌）、胰腺癌、肝 癌、肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌细 胞可能是p53缺陷的癌细胞。可通过测定来测量p53蛋白质或mRNA的表达或活性水平。例如， 该表达水平可以是功能性P53蛋白质的水平。例如，基因组试验可以测量显性阴性突变。 其他生物标志物
[0073] ?1]]\^、84乂、勵乂4、？!1〇^3、]\0^2和!104(：1是1^1?-34活性的其他示例性的生物标志物。 PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2被miR-34上调。HDAC1--一种众所周知的药物靶标--在 用miR-34a转染的细胞中下调，并且已经与转录调控相关联。HDACl转录物在其被miR-34直 接靶向的3 非翻译区(UTR)具有miR-34结合位点，miR-34随后阻抑HDACl。 测定
[0074] 在实施本发明的方法时可使用各种测定来测量参数。在一些实施方案中，测定可 直接或间接测量基因、mRNA和蛋白质的表达或活性。在一些实施方案中，活性测定可用来间 接测量基因、mRNA或蛋白质的表达水平。常见的测定包括但不限于增殖测定、定量逆转录酶 PCR(qRT-PCR)、萤光素酶报道基因测定、ELISA和Western分析。在一些实施方案中，可使用 生物样品，如来自受试者的血液或组织样品，例如肿瘤活检样品进行测定。在一些实施方案 中，其他参数可作为对治疗的响应的指示进行测量。例如，可测量肿瘤大小、凋亡速率、细胞 增殖、脱发等。 供替代的癌症疗法
[0075]本发明的方法可使用除了 m i R-34治疗剂以外的癌症疗法，诸如非mi R-34的 microRNA疗法或非microRNA疗法。这些疗法可与miR-34治疗剂如miR-34疗法结合使用，或 者它们可用作供替代的疗法。排除miR-34治疗剂的癌症疗法在本文中将被称为供替代的疗 法。例如，供替代的疗法可用作"一线"疗法，即，先于施用miR-34治疗剂。在一些实施方案 中，供替代的疗法是microRNA疗法。例如，供替代的疗法可以是mi croRNA，诸如miR-215治疗 剂、miR-192治疗剂或排除miR-34的组合microRNA治疗剂。在一些实施方案中，供替代的疗 法是非microRNA疗法。非microRNA疗法包括但不限于中断的疗法、化学疗法、放射、手术、姑 息疗法、靶向疗法(例如，EGFR-TKI (例如，埃罗替尼、吉非替尼等）、贝伐珠单抗、克唑替尼） 等。 通用
[0076]在本发明的方法中，"施用"不限于任何特定的递送系统，并且可包括但不限于肠 胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌内或腹膜内）、直肠、局部、经皮或□服(例如，以胶 囊、悬浮液或片剂的形式）。可以以单次剂量或重复施用，并以多种生理学上可接受的盐形 式中的任一种，和/或与作为药物组合物的一部分的可接受的药物载体和/或添加剂一起， 向个体施用。生理学上可接受的盐形式和标准的药物配制技术、剂量和赋形剂是本领域技 术人员公知的（参见，例如，Physicians'Desk Reference(PDR?)2005,59th ed. ,Medical Economics Company,2004;和Remington : The Science and Practice of Pharmacy, eds.Gennado等人,21st ed. ,Lippincott ,Williams&Wilkins ,2005) 〇
[0077] 此外，在一种动物中获得的有效剂量可使用本领域已知的转换因子外推以用于另 一种动物，包括人类(参见，例如，Freireich等人,Cancer Chemother Reports 50(4) :219-244( 1966);表2为等效表面积剂量因子）。 表2:等效表面积剂量因子。
[0078] 以下实施例提供了本发明的说明性实施方案。本领域普通技术人员将会认识到， 可进行许多修改和变化而不改变本发明的实质或范围。这样的修改和变化涵盖在本发明的 范围内。这些实施例并非以任何方式限制本发明。 实施例 实施例1-材料与方法
[0079]细胞培养、寡核苷酸和增殖测定。源自MCFlOA乳腺癌的同基因癌细胞和SW48、 HCTl 16、DLD_1 和 RKO 结直肠癌细胞系从 Horizon Discovery Ltd (Cambridge，UK)获得。参见 表3。合成的miRNA模拟物和siRNA从Life Technologies(Ambion,Austin，TX)购买。为了刺 激ΤΡ53途径，用ΙΟμΜ依托泊苷预处理细胞28小时，并采集RNA用于qRT-PCR分析。使用针对 EG5(增殖所需的一种纺锤状蛋白质）的siRNA确定每个细胞系的使用Lipofectamine? 2000 (Invitrogen)或RNAiMAX?( Invitrogen)的最佳转染条件。一式两份或一式三份进行反 向转染。简而言之，向 Lipofectamine? 2000(SW48、MCF1 OA、DLD-1、HCT116)或RNAiMAX (RKO)的每孔20ylOpti-MEM?中加入5μ1寡核苷酸在无 RNA酶水中的溶液。混合物在室 温下温育20min以形成脂质-RNA复合物。然后，加入悬浮在培养基中的75μ1细胞以达到每孔 6,000-10,000个细胞的最终浓度，这取决于每个细胞系的生长速率。约18小时后，去除上清 液并更换为新鲜的培养基。转染后3-4天使用al.am.arB_kie.?_ (Invi trogen，Car I sbad，CA) 确定细胞增殖。沿amarBlue?底物在活细胞中被代谢转化为荧光产物，该荧光产物与活 细胞数成比例。使用Graphpad(Prism)软件计算非线性回归和EC50值。全部的EC50值都在回 归趋势线的95%置信区间(P〈0.05)内。此处所用的EC50值被定义为半数最大miRNA活性。 表3:同基因癌细胞系的TP50基因型
[0080] *如癌症中体细胞突变目录(COSMIC，WWW.sanger.ac.uk)数据库所报道的
[0081 ] 定量逆转录酶PCR。使用mi rVANA?PARI StmRNA分离试剂盒(Amb i on)按照制造商的 说明从培养的同基因癌细胞系中分离总RNA。为了 qRT-PCR检测miRNA，将IOng总RNA和针对 1?8Β-η?Κ-34&、1?8&-η?Κ-215、1?8&-η?Κ-192、1?8&-η?Κ-194、1?8&-η?Κ-341^ΡΠ?8&-η?Κ-34(3φ# 一种的miRNA特异性RT-引物（测定ID 000426、000518、000491、000492、002102、000428; TaqMan?miRNA测定，Applied Biosysterns)在70°C下热变性2min，并使用MMLV逆转录酶 (目录号28025-021，Invitrogen)逆转录。使用Platinum Taq聚合酶试剂（Invitrogen)和 ABI Prism 7900SDS仪器(Applied Biosystems)通过PCR确定miRNA表达水平。如下进行PCR 反应:将样品加热至95°C lmin，接着在多个循环过程中在95°C下温育样品5sec，并在60°C 下温育30sec。管家miRNA miR-191和miR-103(测定ID 002299和000439)作为内部参考扩 增，以对孔间RNA输入差异进行调整。原始Ct值相对于管家miRNA CT的几何平均值进行归一 化，并表示为相对于未处理的、miR-NC或模拟转染的细胞中的值的倍数差异。
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