2] 为了检测人类mRNA，使用IOng总RNA和随机十聚体(AM5722G，Ambion)生成cDNA。使 用多个Taqman基因表达测定（Invitrogen)进行基因特异性扩增。管家GAPDH和亲环蛋白A( Taqman?Invitrogen)的mRNA水平用作加样对照。原始Ct相对于管家mRNA的Ct进行归一 化，并且如上所述进行分析。
[0083]定点诱变。编码与人HDACl的完整3 ' -UTR融合的萤光素酶报道基因的人HDAC13 ' -UTR Lenti-报道基因-萤光素酶载体（pLenti-UTR-Luc HDACl，HDAClwt)从Applied Biological Materials，Inc.购买。进行两轮诱变以在HDAC13 ' -UTR的miR-34结合位点中引 入6个点突变(HDACImut)。为了定点诱变，按照制造商的说明使用QuikChange XL定点诱变 试剂盒（Agilent Technologies)。在首轮中，使用以下引物：SEQ ID NO: 17(CCTCAAGTGA GCCAAGAAAC AATAACTGCC CTCTGTCTGTC)和SEQ ID N0:18(GACAGACAGA GGGCAGTTAT TGTTTCTTGG CTCACTTGAGG)。阳性克隆通过测序(UT Austin)进行验证，并用作使用以下引 物的第二轮诱变的模板：SEQ ID N0:19(GGCCTCAAG TGAGCCAAAA ATAAATAACT GCCCTCTGTC TGTC)和SEQ ID NO:20(GACAGACAGA GGGCAGTTAT TTATTTTTGG CTCACTTGAG GCC)。转染中使 用的所有载体均通过测序进行验证。
[0084] 萤光素酶报道基因测定。SW48-Λ和H1299细胞分别用InM或IOnM miR-34a在96-孔 板中使用lipofectamine2000(Life Technology)进行反向转染。作为对照，用相同浓度的 miR-NC转染细胞。第二天，用各IOOng的HDAClwt或HDAClmut萤光素酶质粒正向转染细胞。48 小时后，制备细胞裂解物并使用来自Pierce (Thermo Scientif ic)的BCA系统进行定量。使 用POLARStar 0Ρ??ΜΑ平板阅读仪(BMG Labtech)和萤光素酶测定系统(Promega)来确定发 光。发光相对于总蛋白质输入进行归一化。
[0085] Western分析。将200,000个SW48和RKO细胞接种在6-孔板中，并用miRNA模拟物和 siRNA在6-孔板中使用2.5μ1 lipofectamine2000或RNAiMax进行反向转染。3天后，将细胞 裂解物收集在RIPA缓冲液(Cell Signaling)中，并使用来自Thermo Scientific的BCA测定 试剂盒测量蛋白质浓度。将各2.5yg的总细胞裂解物加样到12%SDS-PAGE上，然后转移至 PVDF膜。用p21、HDACl、c-MET和肌动蛋白特异性第一抗体(Cell Signaling)在4°C下对膜进 行印迹过夜。该膜在含0.2%Tween?-20的IX磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并与辣根过氧 化物酶偶联的第二抗体一起在室温下温育1小时。用含0.2%Tw een?-20的I X PBS洗涤后，该 膜与ECL检测试剂（Thermo Scientific)-起温育，并使用AFP X射线胶片显影剂（AFP Image Corp.)对蛋白质条带进行可视化。
[0086] 人类组织样品。NSCLC肿瘤样品和相应的正常邻近组织（NAT)从ProteoGenex和 National Disease Research Interchange购买。通过qRT-PCR确定HDAClmRNA和miR_34a水 平，并将其表示为每个肿瘤与NAT对之间的相对表达。使用GraphPad计算线性回归。
[0087] 统计分析。使用Excel和GraphPad( Pri sm)软件进行统计分析。由一式两份或一式 三份实验计算平均值和标准差。通过如图例中所示的双尾Student t-检验或F检验生成P 值。实施例2-miR-34对癌细胞增殖的抑制不依赖于TP53
[0088] 本研究中使用的同基因细胞源自MCFlOA乳腺癌和结直肠癌细胞系SW48、HCT116、 RKO和DLD-I(表3)。在这些细胞中，TP53是野生型（+/+)、杂合的（+/-)或杂合失活的（-/-) (Sur等人，Proc Natl Acad Sci USA 106(10) :3964-9(2009))。亲代DLD-I细胞（DLD-Ipar) 不表达功能性TP53蛋白质，这是由于S241F/SIL TP53基因型中的一个等位基因是突变的， 而另一个是表位(epitopically)沉默的。因此，其中点突变已经通过定点诱变得到校正的 DLD-Ivsil细胞(+/-)用作具有完整TP53的DLD-I参考系（Sur等人，Proc Natl Acad Sci USA 106(10): 3964-9(2009))。每个非同基因细胞系显示出可能影响miRNA的抑制效果的其他肿 瘤抑制基因和癌基因中的突变(表3)。
[0089]为了证实TP53在同基因细胞系中的连续失活，通过将细胞暴露于DNA损伤剂依托 泊苷28小时来诱导TP53响应并收集总RNA。定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)分析显示了 TP53 mRNA和TP53调控的靶基因根据其基因型的等位基因依赖性增加（图2A-2E)。TP53 mRNA在 TP53+细胞中未检测到。TP53调控的基因的提高的mRNA水平类似于发表的数据(Brady等 人，Cell 145(4) :571-83(2011))，并在细胞系之间有所不同，这推测是由于这些基因的细 胞类型特异性调控。同样，TP53调控的砧1?祖、1^1?-343/13/(3、1^1?-192、1^1?-194和1^1?-215的 诱导依赖于细胞系--除DLD-IvIh的所有细胞系都缺乏miR-34b/c表达，而miR-215仅在 SW48和DLD-I细胞中可检测到。
[0090] 同基因细胞用 miR-34a、miR-34c、miR-192、miR-194 和 miR-215 的模拟物转染。 miRNA以系列稀释使用以生成剂量-响应曲线并计算EC50值。作为阴性对照，使用模拟转染 的细胞和用携带杂乱序列的mi RNA转染的细胞（m i R-NC )。温育3-4天后，使用 alani arBlue⑧评估细胞增殖。如图3所示，miRNA模拟物与对照相比将细胞增殖抑制约40-80% JP53增强了miR-215和miR-192抑制癌细胞的能力，并且在MCFlOA和SW48细胞中最大， 与TP53V1H胞相比EC50值低约28-35倍(表4)。相反，miR-34a和miR-34c的抑制活性在TP53 阳性和TP53阴性细胞中是相同的（图3A-6D，表4)。在不存在TP53的情况下，RKO细胞显示更 大的抑制，这进一步证明了TP53不是miR-34诱导的表型的先决条件（图7A-7B)。有趣的是， 在完整TP53的存在下，miR-215/192的最大抑制活性大于miR-34a/c的最大活性，这提示 miR-215/192在TP53正反馈回路中起作用，并利用了仅被TP53调控的辅助途径。 表4: miRNA在同基因癌细胞中的EC50*值。
*EC50值用Pr i sm生成，并且在趋势线的95 %置信区间(P〈0.05)内。 以nM表示数值。 社匕值表示TP53阳性和TP53阴性细胞中的EC50值的倍数差异。 实施例3-在不存在TP53的情况下miR-34a而非miR-215诱导TP53调控的基因
[0091] 为了理解TP53阳性和TP53缺陷的细胞中miR-34诱导的表型，确定与TP53/miR-34 轴有关的基因的表达水平。不依赖TP53的效应的一个可能的解释是这些细胞不表达内源性 SIRTl或MDM4。然而，如通过qRT-PCR所证实的，TP53+/+和TP53-Λ细胞均携带可检测的SIRTl 和MDM4mRNA水平，提示不依赖ΤΡ53的表型不是由于不存在这些基因产物（图8)。相反，根据 显示SIRTl和MDM4被该miRNA直接靶向的实验数据，在用miR-34转染的细胞中这两种mRNA均 减少（Yamakuchi等人，Proc Natl Acad Sci U S A 105(36) :13421-6(2008) ;Mandke等人， PLoS One 7(8):e42034(2012))。类似地，在被相应miRNA转染的细胞中，miR-34a靶标MET和 miR-215靶标BCL2特别地下调（图8) JP53II1RNA水平在SW48-Λ细胞中检测不到，与它确定的 基因型是一致的。在SW48+/1H胞中，TP53mRNA水平是不变的并且符合以下假说:通过这些 miRNA对TP53的正反馈回路不需要TP53的从头合成，而是在转录后发生。这进一步得到以下 观察的证实，该观察显示miR-215诱导在TP53阳性细胞中p21 GIPVwAF1(p21，CDKNlA)的表达， 但在TP53缺陷的细胞中不能诱导表达。出乎意料的是，miR-34a不仅在ΤΡ53 +Λ细胞中而且在 ΤΡ53缺陷的细胞中都能够诱导p21、PUM和MDM2 (图8)。为了确保该现象不是SW48所特有的， 我们测试了用miR-34a转染的所有其他同基因癌细胞，并将该分析扩展至被TP53转录调控 的其他基因。其中包括促凋亡蛋白MX和NOXA以及肿瘤抑制物PHLDA3，PHLDA3是用作AKT/ PKB的负调节物的仅有PH结构域的蛋白质（Kawase等人，Cell 136:535-50(2009))。与来自 SW48细胞的数据相符，不仅在存在功能性TP53的情况下，而且在它不存在的情况下，miR-34a都诱导了六种转录物的积累（图9A和9B)。 实施例4-HDAC1是miR-34a的直接靶标
[0092] p21GIPVwAF1的不依赖TP53的上调的似乎合理的解释是其他TP53家族成员TP63和 TP73的潜在参与。这两种蛋白质发挥了不同于TP53的作用;然而，它们还控制与TP53的基因 重叠的一组基因。测定了已经用miR-34a转染的TP53野生型和TP53缺陷型细胞中TP63和 TP73的内源性mRNA水平。然而，这些细胞均未显示可检测的TP63或TP73水平，提示这些基因 产物的参与是不大可能的(数据未示出）。
[0093]接着，分析了不依赖于TP53的调控机制和可控制p21QP1/WAF1表达的核调节物。感兴 趣的一个候选物是HDACl，因为它在其3'UTR中具有推定的miR-34a结合位点（图10)，在用 miR-34a转染的细胞中下调（图11)，并且已经与在不存在TP53的情况下p21GIP1/WAF1的转录调 控相关(Lagger等人，Mol Cell Biol 23(8) :2669-79(2003))。为了证实HDACl是否被miR-34a直接阻抑，检查miR-34a以确定其是否可以阻抑与完整HDAC13'UTR(SEQ ID N0:21)融合 的萤光素酶报道基因。该报道基因在缺乏内源性miR-34a的两种细胞系中瞬时表达。然后， 细胞用miR_34a(SEQ ID N0:3)或miR-215(SEQ ID N0:1)转染，预计后者不阻抑HDAC1，因此 用作阴性对照。如图12A所示，在两种细胞系中miR-34a的转染相对于对照使发光减弱了约 50%。该阻抑在miR-34a结合位点突变(SEQ ID N0:22)时被完全消除（图12A)，提示HDACl 3'UTR在该位点处被miR-34a直接靶向。为了进一步评价在人类肿瘤试样中是否表现出 HDACl的miR-34a依赖性阻抑，我们检查了先前所用的一组14个非小细胞肺癌样品以证明降 低的miR-34a表达水平(Wiggins等人，Cancer Res 70(14) :5923-30(2010))。通过qRT-PCR 确定肿瘤HDAClmRNA和miR-34a水平，并将其相对于它们各自正常的邻近组织中的水平进行 归一化。通过Pearson方法的分析显示了 HDAClmRNA与miR_34a水平之间统计显著的负相关 (图12B)，这支持了miR-34a在调控人类肿瘤的HDACl中的作用。 实施例5-HDAC1的抑制模拟miR-34a表型
[0094]先前的结果表明HDACl与p21eiPVwAF1基因的调控有关。例如，HDACl缺陷的胚胎干细 胞显示升高的p21GIPVwAF1水平，并且使用HDAC抑制剂曲古抑菌素 A(TSA)对HDACl的抑制可在 不存在TP53的情况下诱导p21GIPVwAF1表达（Sowa等人，1997;Lagger等人，2002)。为了证实 HDACl消耗时p21GIP1/WAF1的不依赖TP53的诱导，我们用针对HDACl的siRNA转染TP53阴性细 胞，并通过蛋白质印迹法评估细胞裂解物。该结果与用miR-34a或miR-215转染的细胞进行 比较。测试两种细胞系，并且其包括模拟处理的和miR-NC处理的细胞作为阴性对照。正如所 预