期的，Met仅在用miR-34a转染的细胞中下调，而miR-34a和HDAClsiRNA减少了HDACl蛋白 质（图13-14)。需要注意的是，这两种寡核苷酸均诱导了在这些细胞中p21 QP1/WAF1蛋白质表 达的明显增加。这一观察与不能在TP53缺陷型细胞中诱导p21QP1/WAF1的miR-215形成鲜明对 比。然而，miR-215转染至TP53阳性细胞中导致TP53阳性细胞中p21 QPVwAF1蛋白质的增加（图 15)，这符合以下假说:作为从miR-215至TP53的正反馈回路的结果，p21GIPVwAF1的miR-215依 赖性诱导由TP53介导（Picchiori等人，Cancer Cell 18(4) :367-81(2011))。
[0095] 为了探索HDACl的抑制是否能模拟miR-34a表型，我们测量了针对HDACl的siRNA在 TP53阳性和TP53缺陷型SW48细胞中的增殖效果。细胞也用针对可拮抗TP53功能的基因产物 的一系列其他siRNA进行转染。这些基因包括YYl、MDM4和SIRTl，以及是被证实或预测的 miR-34a靶标并且在miR-34转染的细胞中受到阻抑的一些其他基因（数据未示出hsiRNA的 瞬时转染导致靶mRNA的>80%的敲减，如通过qRT-PCR所证实的（图16A-16G)。作为对照，还 用miR-34a和miR-215转染细胞。我们试图鉴定在两种细胞系中产生类似的癌细胞抑制水平 的siRNA。正如所预期的，miR-34a同等地抑制SW48 +/+和SW48V_细胞，并且miR-215的活性依 赖于TP53(图17)。大多数siRNA不能在任一种细胞类型中减少细胞增殖，其包括针对SIRTl 和YYl的SiRNA13MDiM的敲减能够抑制SW48+A细胞的增殖，但在SW48 V1H胞中没有效果。这令 人想起miR-215表型，并证实了MDM4在调节TP53反式激活而非DNA调控中的作用(Toledo等 人，2006)。相反，HDACl的敲减抑制了癌细胞生长，类似于miR-34a，这在两种同基因细胞系 中是相同的。从用曲古抑菌素 A处理的细胞中获得了类似的结果（图18A-18B)，这进一步证 实了 HDACl在通过p21QP1/WAF1介导miR-34a响应中的作用。 实施例6-p21的消耗干扰癌细胞增殖的mi R-34a诱导的抑制。
[0096] 在各种细胞系中生成的剂量-响应数据提示，P21QP1/WAF1表达是癌细胞增殖的miR-34a诱导的抑制过程中的关键事件。p21 GIP1/WAF1的表达水平与miR-34a抑制TP53阳性和TP53 阴性细胞的能力明显相关。例如，miR-34a的抑制活性在MCFIOA和SW48细胞中是相同的，并 且与TP53- Λ和ΤΡ53+Λ细胞中类似的p21GIPVwAF1表达水平相关（图3)。相比于TP53- Λ细胞，在 ΤΡ53+/+细胞中，HCT116表现出更高的p21CIP1/WAF1mRNA水平，这与在更高miR-34a浓度(30ηΜ， 图3)下ΤΡ53 +/+细胞中略微增加的miR-34a抑制活性一致。在RKO细胞中，p21CIP1/WAF1水平在 TP53V_细胞中较高，并且反映了在RKO+细胞中相比在RKOv+细胞中更大的增殖抑制（图7A-7Β) WIgipvwafi的诱导在低miR-34a浓度下也是明显的，并且与细胞增殖的抑制负相关（图 19)〇
[0097] 为了讨论miR-34a诱导的表型是否需要p21GIP1/WAF1表达，我们通过用miR-34a和针 对p21QP1/WAF1的siRNA共转染细胞进行了干扰试验。作为对照，用miR-34a、miR-215或miR-NC 转染细胞。每种miRNA均补充了阴性对照寡核苷酸，使得转染的RNA的总量等于miR-34a/si-p21组合之一。革El向基因的下调通过Western分析进行验证（图20)。单独的miR-34a使RKO细 胞的增殖降低约20-30% (图21)。相反，miR-34a/si-p21组合对癌细胞增殖没有影响，并且 提示p21GIPVwAF1表达实际上是介导miR-34肿瘤抑制物响应中的必要因素。p21GIP1/WAF1依赖性 表型在同基因 SW48癌细胞（图22)和缺乏p21GIP1/WAF1的TP53阴性Hep3B肝癌细胞（图23)中是 可再现的。 实施例7-miR-34a模拟物的全身递送在体内诱导肿瘤中p21QP1/WAF1的表达。
[0098]为了讨论在荷瘤动物中miR-34a是否能诱导p21GIPVwAF1的上调，将Hep3B肝细胞癌 细胞经手术植入N0D/SCID小鼠肝脏的左侧叶。Hep3B癌细胞缺乏功能性TP53。大约5周后，当 小鼠形成可检测到的大肿瘤时，通过静脉内尾静脉注射施用单剂量的浓度为lmg/kg小鼠体 重的miR-34a模拟物。该miR-34a模拟物是含有miR-34a的模拟物的脂质体制剂。lmg/kg的剂 量等价于20yg π?Κ-34&(324小时后，处死小鼠，然后收集肿瘤组织以用于蛋白质裂解物制 备。通过Western分析探测裂解物以确定p21 GIP1/WAF1蛋白质的表达。如图24A所示，三个MRX34 治疗的小鼠中的两个表达了高水平的p21eiPVwAF1。相反，对照肿瘤均不显示p21 QPVwAF1蛋白 质的升高的表达。类似地，用miR-34a瞬时转染的Hep3B细胞显示出p21GIPVwAF1的上调。图 24B。数据提示，基于miR-34a的疗法能够在缺乏功能性TP53的肿瘤中诱导p21 QP1/WAF1。
【主权项】
1. 一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括： (a) 针对存在或不存在miR-34活性的至少一种先决生物标志物筛选受试者； (b) 如果确定存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用miR-34治疗剂；以 及 (c) 如果确定不存在miR-34活性的先决生物标志物，则向该受试者施用供替代的疗法， 从而治疗该受试者。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、乳 腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物选自p21eipl/WAF1、 PUMA、ΒΑΧ、NOXA、PHLDA3、MDM2和HDAC1。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物包括p21QP1/WAF1。5. 根据权利要求4所述的方法，其中筛选受试者所针对的唯一的先决生物标志物为 p21CIP1/WAF1〇6. 根据权利要求1所述的方法或用途，其中miR-34为 、miR_449b或miR_449c。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法是中断的疗法。8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述miR-34治疗剂包括miR-34并且还任选包括 miR-215和miR-192中的至少一种。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法为非miR-34的microRNA疗法。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述供替代的疗法选自化学疗法、放射疗法和手 术，并且还任选包括miR-215和miR-192中的至少一种。11. 根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p21QP1/WAF1阳性癌细胞。12. 根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p21eipl/WAF1阳性癌细胞 和p53缺陷的癌细胞。13. 根据权利要求12所述的方法，其中已经确定所述受试者具有缺乏功能性p53蛋白质 的癌细胞。14. 根据权利要求13所述的方法，其中已经确定所述受试者具有含有野生型或杂合 p21QP1/WAF1基因的癌细胞。15. 根据权利要求1所述的方法，其中已经确定所述受试者具有p53缺陷的癌细胞，针对 存在或不存在P21eipi/WAF1筛选所述受试者，如果确定存在p21eipl/WAF1则向所述受试者施用 miR-34治疗剂，并且如果确定不存在p21QP1/WAF1则中断miR-34治疗剂。16. -种确定用miR-34治疗剂治疗的受试者对癌症疗法的响应的方法，该方法包括： (a) 测定所述受试者中miR-34活性的至少一种生物标志物的第一水平； (b) 向所述受试者施用miR-34治疗剂； (c) 测定所述受试者中该生物标志物的第二水平； (d) 如果相对于该第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效，则进一步向所述 受试者施用miR-34治疗剂；以及 (e) 如果相对于该第一水平的第二水平指示出miR-34治疗剂的功效不足，则向所述受 试者施用供替代的疗法， 从而确定所述受试者对癌症疗法的响应。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、 乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。18. 根据权利要求16所述的方法，其中从所述第一水平至所述第二水平的10%差异指 示出所述miR-34治疗剂的功效。19. 根据权利要求16所述的方法，其中(b)和(d)中的miR-34治疗剂是相同的。20. 根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法是非microRNA疗法。21. 根据权利要求16所述的方法，其中所述非microRNA疗法是中断的疗法、化学疗法、 放射疗法或手术。22. 根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法为非miR-34的microRNA疗法。23. 根据权利要求16所述的方法，其中所述供替代的疗法包含miR-215和miR-192中的 至少一种。24. 根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种生物标志物是miR-34活性的先决 生物标志物。25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物选自p21eipl/WAF1、 ?1]獻、8六乂、从^、?!11^3和]\^2，并且其中如果第二水平高于第一水平则指示出功效。26. 根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物是HDAC1，并且其 中如果第二水平低于第一水平则指示出功效。27. 根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种先决生物标志物是p21eipl/WAF1，并 且其中所述供替代的疗法是中断的疗法。28. -种处理受试者中的癌细胞的方法，其包括： 选择具有P53缺陷的且p21QP1/WAF1阳性的癌细胞的受试者，并用miR-34治疗剂治疗该受 试者。29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者患有肺癌、胰腺癌、肝癌、肝细胞癌、 乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌或结肠癌。30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者患有膀胱癌、食管癌、乳腺癌或胃癌。31. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有白血病、急性淋巴母细胞白血病 (ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细 胞淋巴瘤(SLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、淋巴瘤、霍奇金淋巴 瘤(全部四种亚型）、滤泡性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(全部亚型）、骨髓瘤、多 发性骨髓瘤或骨髓发育不良综合征。32. 根据权利要求1所述的方法，其中所述先决生物标志物是DNA、mRNA或蛋白质。33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述DNA为非沉默的基因并且它没有任何失活突 变。34. 根据权利要求1所述的方法，其中（i)所述至少一种先决生物标志物选自p21eipl /WAF1、PUMA、ΒΑΧ、N0XA、PHLDA3和MDM2，并且(ii)所述至少一种先决生物标志物的存在包括等 于或高于参考水平的表达水平或活性水平。35. 根据权利要求1所述的方法，其中（i)所述至少一种先决生物标志物是HDAC1;并且 (ii)所述至少一种先决生物标志物的存在包括等于或低于参考水平的表达水平或活性水
【专利摘要】本发明部分地基于以下发现：miR-34不依赖于p53。已发现miR-34在不依赖TP53的肿瘤抑制途径中起作用。具体地，发现癌细胞生长的miR-34诱导的抑制在p53正常的和p53缺陷的细胞中是相同的。因此，miR-34在不与p53耦合的肿瘤抑制过程中具有更主要的作用。在不存在p53的情况下，不同于某些其他的miRNA，miR-34足以诱导已知由p53调控的基因的上调，该基因包括但不限于p21CIP1/WAF1(CDKN1A)、PUMA、BAX、NOXA、PHLDA3和MDM2，并且诱导HDAC1的下调。因此，这些生物标志物可用作miR-34活性的生物标志物。本发明还基于以下发现：这些生物标志物中的一些对于对miR-34活性的治疗响应是不可或缺的，因此是miR-34活性的先决生物标志物。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105473742
【申请号】CN201480046826
【发明人】安德里斯·巴德, 简·赵
【申请人】米尔纳疗法公司
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2014年6月24日
【公告号】CA2914685A1, EP3013975A1, US20140378528, WO2014209970A1