方案中，可仅仅通过增加或减少并行实 施的纳升级扩增的数量来容易地缩放扩增方法。在一些实施方案中，从扩增的核酸中制备 测序文库。在一些实施方案中，所述文库包括随机断裂和连接文库。
[0026] 单细胞的基因组测序可具有多种应用，包括但不限于识别难以培养的微生物以及 鉴定来自哺乳动物组织的单细胞的体细胞突变。该方法的主要障碍可能是被称作聚合酶克 隆的步骤的从单细胞扩增并产生遗传物质的多个拷贝中的偏差。本文的一些实施方案提供 微孔置换扩增系统(MIDAS)，其为大规模并行聚合酶克隆方法，其中单细胞随机分配于纳升 级体积的成百上千个微孔中，并同时进行扩增以用于鸟枪法测序。在一些实施方案中，通过 在纳升级反应中实施聚合酶克隆，MIDAS显著降低了扩增偏差，所述聚合酶克隆允许从头组 装来自单大肠杆菌细胞的几近完全的微生物基因组。在一些实施方案中，MIDAS允许以1-2Mb的分辨率检测主要的成人神经元的单拷贝数改变。MIDAS能够帮助描述多种异质细胞群 中的基因组多样性特征。也考虑由于根据本文一些实施方案的扩增反应是在单一反应环境 中实施的，因而可利用小的移动部分来实施这些反应(例如，仅用移液器向反应环境中添加 溶液或从反应环境中移出溶液）。因此，可高程度可靠地实施根据本文一些实施方案的扩增 反应，同时将对另外部件的需求最小化，如移动部分以及此类移动部分的滑板(chasses)和 操作软件。在一些实施方案中，在单一反应环境中实施扩增。在一些实施方案中，在除用于 向反应环境中添加和/或移出溶液的一个或多个移液器之外，不具有流体通道或其它流体 系统活动的情况下实施扩增。在一些实施方案中，在与流体通道网络无流体连通，并且不是 配置为与流体通道网络进行流体连通的反应环境中实施扩增。
[0027] -些实施方案允许以无偏差的方式并行进行多个单细胞的全基因组扩增。在纳升 体积中可同时扩增数百个(或更多个)细胞。一些实施方案包括低输入测序文库构建技术， 以使可对直接来自全基因组扩增的DNA进行测序。扩增的无偏差性质可允许无数的下游应 用，包括不可培养的细菌的从头组装以及单一哺乳动物细胞的拷贝数变异的检出。
[0028] 根据本文的一些实施方案，核酸扩增的方法是容易缩放的。取决于待实施的扩增 反应的期望数量，可选择多个纳升级反应环境(例如孔）。可将模板(例如单细胞或单细胞的 基因组)稀释以使每一反应环境有大约不多于一个模板，并且将稀释的模板分配于期望数 量的反应环境中。在一些实施方案中，提供至少一个包含多个纳升级反应环境的基板。如果 反应的期望数量少于基板上反应环境的数量，则可仅使用反应环境中的一些。如果反应的 期望数量大于基板上反应环境的数量，则可使用两个或更多个基板，例如2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 个基板，包括任意两 个列出的数值之间的范围。本文考虑可缩放性向操作者提供了灵活性。此外，由于可用最少 的移动部分来实施根据本文一些实施方案的扩增反应，因此在不对基板构造(如操作软件、 机械部件、流体系统等)进行任何实质性的定制或重新设计的情况下，扩增反应的数量可被 容易地缩放。因此，在一些实施方案中，可并行实施大量的扩增反应。在一些实施方案中，可 并行实施至少2 个扩增反应，例如至少2、3、4、5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、 650、700、750、800、850、900、950、1000，1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、 5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10000个扩增，包括任意两个列出的 数值之间的范围。
[0029] 核酸扩增
[0030] 传统的单细胞全基因组扩增技术扩增基因组具有较大偏差。基因组中的小部分区 域可被大量扩增，而大部分基因组可被极少扩增。因此，需要大量的测序投入以解析任何基 因组。因而下游应用如从头组装或拷贝数变异检出可能是十分困难且不准确的。
[0031] 在一些实施方案中，单细胞的全基因组被无偏差地扩增。在一些实施方案中，单细 胞的全基因组被基本无偏差地扩增。本文使用的"基本无偏差的"以及该词根的复数、词形 变化、变体等是指基因组的扩增，其中当扩增的基因组被分为先前确定的至少100个基因组 库以使定位之后每个基因组库都包含相似数量的读取(参见，例如 3())时，至少80%的所述库 的log1()倍数扩增在平均数±20%之内（即对于至少80%的基因组库，其倍数扩增的1吨 10不 比全基因组拷贝平均数多20%，并且不比全基因组拷贝平均数少20%)。在一些实施方案 中，至少80 %的库的log1Q倍数扩增在平均数± 20 %之内，例如至少约80 %、85 %、90 %、 95%、99%或99.9%。当全基因组扩增为基本无偏差或无偏差时，大部分基因组可被扩增至 相似的程度。因此，对于下游分析而言，需要相对较少的测序投入。从头组装的完成以及拷 贝数变异的检出可具有更高的准确性。
[0032] 如本文所使用的，"纳升级"指体积，例如反应环境中的体积，其为至少约1纳升并 且不大于50纳升，更优选约5纳升-约30纳升，更优选约10纳升-约25纳升，例如约12纳升或 约20纳升。
[0033] 在一些实施方案中，将细胞稀释并使其在基板上的整个上样区中均匀分布，其中 所述上样区包含数百个纳升级反应环境以使至少99%的反应环境中每孔含有不多于1个细 胞。在一些实施方案中，基板包括PDMS载玻片。在裂解和变性之后，可利用多重置换扩增 (MDA)来扩增DNA。可以以缓冲液的形式提供MDA反应物，所述缓冲液包含聚合酶、dNTP、随机 寡核苷酸以及扩增-检测部分，如SYBR?绿染料。可在温度受控并且与扩增-检测部分的检测 器如显微镜存在光学通讯的环境中实施MDA。在不受任何理论限制的情况下，小体积以及随 后的高浓度模板能够允许无偏差的全基因组扩增。在扩增中用扩增-检测部分染色，例如 SYBR?绿，允许因为可测定信号随时间的增加而观察到阳性扩增。然后利用显微操作器自动 或手动移出阳性扩增，并置于管内。一些实施方案包括能够利用亚纳克的DNA输入的低输入 测序文库构建方法。然后可将复杂的MDA扩增子变性，并产生简单的线性DNA。可将线性DNA 用于构建测序文库。在一些实施方案中，在添加测序适配子时，具有Illumina测序适配子 (Nextera)的转座子然后将DNA片段化。因此，可制备测序文库。考虑根据本文的实施方案基 本无偏差扩增的核酸可被用于多种下游应用，包括技术人员已知的任何数量的基因组测序 技术。
[0034] 用于扩增核酸的多种技术对技术人员而言是已知的。扩增核酸的示例性技术包括 但不限于:聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)例如多重置换扩增(MDA)、环介导等温 扩增(LAMP)、连接酶链式反应(LCR)、免疫-扩增，以及多种基于转录的扩增方案包括转录介 导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)以及滚环扩增。参见，例 如Mul1is，"Process for Amp 1ifying，Detecting，和/或Cloning Nucleic Acid Sequences，〃U.S·Pat·No·4，683，195;Walker，"Strand Displacement Amplification，〃 U·S·Pat·No·5，455，166;Dean et al，"Multiple displacement amplication," U.S.Pat.No.6,977,148；Notomi et al./'Process for Synthesizing Nucleic Acid," U.S.Pat.No.6,410,278;Landegren et al.U.S.Pat.No.4,988,617"Method of detecting a nucleotide change in Nucleic Acids";Birkenmeyer，"Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction,.S.Pat.No.5,427,930； Cashman，"Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit," U·S·Pat·No·5，849，478;Kacian et al.,^Nucleic Acid Sequence Amplification Methods,.S. Pat. No .5,399,491；Ma1ek et al. ,^Enhanced Nucleic Acid Amplification Process ,^U.S. Pat. No .5,130,238；Lizardi et al·，BioTechnology，6: 1197(1988)；Lizardi et al. ,U.S. Pat. No .5,854,033 uRolling circle replication reporter systems"，在此将每一项以引用的方式整体并入本文。优选地，根据本文的一些 实施方案可使用MDA IDA可包括将随机寡核苷酸引物与模板核酸退火，并将寡核苷酸引物 向前延伸至最接近的下游寡核苷酸引物的退火位点，从而形成分支的扩增核酸。可以在恒 定的温度下实施MDA，并且与常规的PCR相比，其可以产生相对更大的产物并具有相对较低 的错误率。根据本文的实施方案，可使用多种MDA试剂。在一些实施方案中，用链置换聚合酶 实施MDA。在一些实施方案中，所述链置换聚合酶包括高保真DNA聚合酶，例如Φ29?ΝΑ聚合 酶。
[0035] 根据本文的一些实施方案产生的扩增的倍数的量可取决于模板的量以及反应物 的总质量。根据本文的一些实施方案，实施扩增直至饱和(例如直至另外的扩增周期不再处 于对数期，从而另外的周期产生较少的扩增子至不再产生另外的扩增子）。在不受任何理论 限制的情况下，考虑扩增的总量与反应的总质量成比例，并且与扩增的模板的大小成反比。 因此，例如，根据本文的一些实施方案，鉴于相同的反应质量和扩增直至饱和，1Mb的基因组 的扩增为1 〇Mb基因组的扩增的大约10倍。
[0036]在不受任何理论限制的情况下，本文考虑根据本文的一些实施方案的高浓度的扩 增反应物和模板，能够促进全部模板或基本全部模板(例如基因组材料)基本无偏差地扩 增。为了提供高浓度的反应物，包括但不限于模板，在本文的一些实施方案中，模板与反应 体积的比例可以相对较高。因此，在一些实施方案中，配置纳升级反应环境以用于高比例的 基因组材料与反应体积比。在一些实施方案中，配置纳升级反应环境以用于至少约0.02百 万个碱基的基因组材料/纳升反应体积，例如至少约0.02、0.03、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、 0·3、0·35、0·4·、0·45、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1、2、3,4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、 70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、 950、1000、1500、2000、2500、3000、4500或5000百万个碱基的基因组材料/纳升，包括任意两 个列出的数值之间的范围。在一些实施方案中，配置纳升级反应环境以用于至少约0.03百 万个碱基的基因组材料/纳升反应。在一些实施方案中，配置纳升级反应环境以用于至少约 0.3百万个碱基的基因组材料/纳升反应。在一些实施方案中，配置纳升级反应环境以用于 至少约100百万个碱基的基因组材料/纳升反应。在一些实施方案中，配置纳升级反应环境 以用于至少约200百万个碱基的基因组材料/纳升反应。本文还考虑配置纳升级反应环境， 以使当本文所述的将包含稀释的全部细胞或其部分的液体应用于基板时，基本上每个纳升 级反应环境仅包含一个基因组(或包含基因组的细胞）。因此，在一些实施方案中，配置每个 纳升级反应环境以使施用包含细胞或其片段的溶液之后，至少约95%的纳升级反应环境仅 包含一个细胞，例如使至少约95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、 99.8%、99.9%或99.99%的纳升级反应环境仅包含一个细胞。
[0037] 虽然根据本文的一些实施方案的基本无偏差的扩增可用于多种应用，一个有用的 应用包括基因组测序。考虑根据本文的一些实施方案的基本无偏差的扩增获得了全部或基 本全部模板基因组的扩增，其覆盖度水平可用于测序。在一些实施方案中，配置纳升级反应 环境以用于以>1Χ的覆盖度扩增至少约90%的全基因组，例如至少约90%、91 %、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%的基因组，包括任意两个列出的 数值之间的范围。
[0038] 在一些实施方案中，产生无支链的扩增子以用于文库构建。如本文所使用的，"基 本上所有的扩增子都是无支链的"等指至少约70 %的扩增子（例如约70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、97%、98%、99%或99.9%)不具有多链置换的分支特征，而是为无支链的 双链DNA分子。在不受任何理论限制的情况下，注意到MDA产物通常是高度分支的。在一些实 施方案中，可通过使MDA产物与DNA聚合酶I相接触以从MDA产物中产生无支链的扩增子。 [0039]多种测序技术对本领域技术人员而言是已知的，并且可根据本文的实施方案来使 用。测序技术的选择取决于多种因素，例如被扩增的基因组的大小和特征。由于本文的多个 实施方案包括大规模并行扩增或测序或者可与之相容，因而可将与快速、大规模的"第二 代"测序相容的测序技术用于本文的一些实施方案。示例性的测序技术包括Illumina? (Solexa)测序（Illumina)、Ion Torrent?测序（Life Technologies)、S0LiD?测序（Life Technologies)等。
[0040] 扩增-检测部分
[0041] 在一些实施方案中，扩增-检测部分被用于监测扩增过程。如本文所使用的，"扩 增-检测部分"广泛指任何数量的检测部分，其在扩增产物(例如双链核酸)存在的情况下产 生可检测类型或强度的信号，而在扩增产物不存在的情况下不产生信号（或仅产生低水平 的信号或背景信号）。第一类扩增-检测部分包括与双链DNA特异地结合的染料，例如嵌入 剂。当这些染料未结合时，其具有相对较低的荧光，而当这些染料与双链核酸结合时，其具 有相对较高的荧光。同样地，可将选择性地检测双链的染料用于监测扩增反应过程中的双 链核酸积聚。选择性地测定双链DNA的染料的实例包括但不限于:SYBR?绿I染料(Molecular Probes)、SYBR?绿II染料（Molecular Probes)、SYBR?金染料（Molecular Probes)、 Picogreen染料(Molecular Probes)、Hoechst 33258(Hoechst AG)以及花青二聚体染料家 族，如YOYO染料家族(例如YOYO-1和YOYO-3)、Τ0Τ0染料家族（例如ΤΟΤΟ-l和T0T0-3)等。其它 类型的扩增-检测部分应用序列特异的核酸探针的衍生物。例如，用一种或多种染料标记的 寡核苷酸探针，以使当与模板核酸杂交时，产生荧光的可检测的变化。该类中示例性的扩 增-检测部分包括但不限于Taqman?探针、分子信标等。虽然非特异的染料对某些应用而言 是可取的，但是序列特异的探针可提供更准确的扩增测量。序列特异的探针的一种结构可 包含与荧光基团相连的探针的一端和与淬灭基团相连的探针的另一端。当探针未杂交时， 其可维持茎-环结构，其中荧