nell，M.J.，Marchetto，M.C.，Coufal，N.G.&Gage，F.H.LINE-1retrotransposons:mediators of somatic variation in neuronal genomes?Trends Neurosci 33,345-354(2010).
[0149] 29.ffestra?J.ff.et al.Neuronal DNA content variation(DCV)with regional and individual differences in the human brain.J Comp Neurol 518，3981-4000 (2010).
[0150] 30 · Baslan，T · et al · Genome -wide copy number analysis of single cells.Nat Protoc 7,1024-1041(2012).
[0151] 31·Shendure，J.et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome.Science 309?1728-1732(2005).
[0152] 32·Zong，C·，Lu，S·，Chapman，A.R.&Xie，X.S.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science 338,1622-1626(2012).
[0153] 33. Hussein ? S.M.et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.Nature 471，58_62(2011)·
[0154] 34.ffestra?J.ff.et al.Aneuploid mosaicism in the developing and adult cerebellar cortex.J Comp Neurol 507?1944-1951(2008).
[0155] 35.Huson，D.H.，Auch，A.F.，Qi，J.&Schuster，S.C.MEGAN analysis of metagenomic data.Genome Res 17?377-386(2007).
[0156] 36.Gurevich?A. ?Saveliev?V. ? Vyahh i?N.&Tesler?G.QUAST :quali ty assessment tool for genome assemblies.Bioinformatics 29?1072-1075(2013).
[0157] 37. Aziz ?R.K.et al. The RAST Server:rapid annotations using subsystems technology.BMC Genomics 9?75(2008).
[0158] 38·Moriya，Y·，Itoh，M·，Okuda，S·，Yoshizawa，A·C·&Kanehisa，M·KAAS: an automatic genome annotation and pathway reconstruction server.Nucleic acids research 35，W182-185(2007)·
[0159] 39.Fan?Christina et al.Whole genome molecular haplotyping of single cells Nature Biotech
[0160] 40.Zhong?Chenghang et al.Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell Science 3381622(2012)
[0161] 41.Zhang?Kun et al.Sequencing Genomes from Single Cells by Polymerase Cloning Nature Biotech
[0162] 42·Evrony，Gilrad et al . Single Neuron Sequencing Analysis of LIRetrotransposition and Somatic Mutation in the Human Brain Cell 151 483 (2012)
[0163] 43.Kirkness ?E.F.et al. Sequencing of isolated sperm cells for direct haplotyping of a human genome.Genome Res·23,826_832(2013).
[0164] 44. Lu ，S.et al.Probing meiotic recombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genome sequencing.Science 338?1627-1630(2012).
[0165] 将本文引用的所有参考文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0166] 在本申请中，使用的单数可包括复数，除非另外特别指明，或者除非本领域技术人 员根据本公开内容将会理解，单数是仅有的功能性实施方案。因此，例如，"一"可以表示多 于一个，以及"一个实施方案"可以表示描述适用于多个实施方案。
[0167] 前面的描述以及实施例详述了某些实施方案。但是应当理解，无论文本中出现的 前述多么详细，本发明可以以多种方式实施，并且应当根据所附的权利要求书及其任何等 同的内容来解释本发明。
【主权项】
1. 产生基本无偏差的单细胞基因组扩增文库的方法，所述方法包括： 在配置以用于基本无偏差的基因组扩增的纳升级反应环境中扩增单细胞的基因组;和 构建包含基本无偏差的基因组扩增的多个扩增子的文库。2. 如权利要求1所述的方法，其中扩增所述单细胞的基因组包括多链置换扩增(MDA)， 所述多链置换扩增包括使所述反应环境与(a)链置换聚合酶和(b)多个随机DNA多聚物相接 触，从而产生基本无偏差的单细胞基因组的扩增。3. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基因组核酸的量与纳升级反应环境的体 积的比率为至少约0.03百万个碱基对/纳升。4. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中基因组核酸的量与纳升级反应环境的体 积的比率为至少约200百万个碱基对/纳升。5. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中配置所述纳升级反应环境用于以大于1 X的覆盖度扩增至少约90%的基因组。6. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳升级反应环境包含不大于约20nL 的体积。7. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳升级反应环境包含不大于约12nL 的体积。8. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在单基板的多个纳升级反应环境中 扩增多个单细胞的基因组，其中至少95%的所述反应环境不包含除单细胞的基因组之外的 任何基因组。9. 如权利要求8所述的方法，其中至少99%的所述反应环境不包含除单细胞的基因组 外的任何基因组。10. 如权利要求8或9所述的方法，其中配置所述基板以用于单次移液操作，从而将所述 单细胞的基因组分配于所述反应环境中。11. 如权利要求8-10中任一项所述的方法，其还包括： 选择期望数量的反应环境;和 仅在所述期望数量的反应环境中扩增多个单细胞的基因组。12. 如权利要求8-11中任一项所述的方法，其还包括鉴定已经实现期望水平的扩增的 反应环境，其中从所述已经实现期望水平的扩增的反应环境构建文库。13. 如权利要求8-12中任一项所述的方法，其还包括从多个反应环境中构建多个文库， 其中所述多个文库的数量与所述多个反应环境的数量相同或不同。14. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在纳升级反应环境中扩增单细胞的基 因组包括在存在扩增-检测部分的情况下进行扩增。15. 如权利要求14所述的方法，其中所述扩增-检测部分包含花青染料。16. 如权利要求14-15中任一项所述的方法，其中来自所述扩增-检测部分的信号鉴定 已经实现期望水平的扩增的反应环境。17. 如前述上权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应环境不包含除所述单细胞 之外的任何细胞。18. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应环境不包含除单细胞的基因 组之外的任何基因组。19. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述随机多聚物选自：五聚物、六聚物、 七聚物、八聚物、九聚物以及十聚物。20. 如权利要求19所述的方法，其中所述随机多聚物为六聚物。21. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个扩增子基本上全部是无支链 的。22. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括在构建所述文库之前，从所述反应 环境中移出多个扩增子中的至少一些。23. 如权利要求22所述的方法，其中移出多个扩增子中的至少一些包括显微操作。24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个扩增子包含不多于约100皮 克-约10纳克的DNA。25. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库包括基于转座酶的文库。26. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库包括基于Tn5转座酶的文库。27. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库包括随机断裂和连接文库。28. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单细胞为人细胞或微生物细胞中 的一种。29. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述单细胞包括不可培养的或基本不 可培养的细菌细胞。30. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MDA包括实时MDA。31. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中对两个或更多个单细胞的两个或更多 个基因组并行实施所述方法，从而并行产生两个或更多个无偏差的扩增文库。32. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括下列中的至少一项:人肠道中不可 培养的细菌的从头组装、异质环境如海水中不可培养的细菌的从头组装、单神经元的拷贝 数变化检出，单个癌细胞或循环肿瘤细胞的拷贝数变化检出，或者人类单体型分析。33. 通过多链置换扩增(MDA)产生基本无偏差的基因组扩增的方法，所述方法包括： 在纳升级反应环境中提供所述基因组;和 使所述纳升级反应环境与(a)链置换聚合酶和(b)多个随机DNA多聚物相接触，从而产 生基本无偏差的基因组扩增。34. 如权利要求33所述的方法，其还包括构建包含所述基本无偏差的基因组扩增的多 个扩增子的文库。35. 如权利要求33-34中任一项所述的方法，其中配置所述纳升级反应环境以以大于1 X的覆盖度扩增至少90%的基因组。36. 如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述基因组核酸的量与所述纳升级反 应环境的体积的比率为至少约0.3百万个碱基对/纳升。37. 如权利要求33-36中任一项所述的方法，其中所述基因组核酸的量与所述反应环境 的体积的比率为至少约200百万个碱基对/纳升。38. 如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述随机多聚物选自：五聚物、六聚 物、七聚物、八聚物、九聚物以及十聚物。39. 如权利要求38所述的方法，其中所述随机多聚物为六聚物。40. 如权利要求33-39中任一项所述的方法，其中所述多个扩增子基本上全部是无支链 的。41. 如权利要求33-40中任一项所述的方法，其中所述纳升级反应环境包括促进单细胞 基本无偏差扩增的纳升级反应环境。42. 如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所述纳升级反应环境包含不大于约 20nL的体积。43. 如权利要求33-41中任一项所述的方法，其中所述纳升级反应环境包含不大于约 12nL的体积。44. 如权利要求33-42中任一项所述的方法，其中所述反应环境包含不多于一种基因组 的可能性为至少99%。45. 如权利要求33-44中任一项所述的方法，其还包括下列中的至少一项：人肠道中不 可培养的细菌的基因组的从头组装、异质环境中不可培养的细菌的从头组装、单神经元的 拷贝数变化检出、单个癌细胞或循环肿瘤细胞的拷贝数变化检出，或者人类单体型分析。46. 用于基本无偏差的扩增至少一种单细胞的基因组的基板，所述基板包括： 多个上样区，其中配置每个上样区以接收液体样品，每个上样区包括： 促进单细胞基本无偏差的扩增的多个纳升级反应环境。47. 如权利要求46所述的基板，其中配置所述多个纳升级反应环境以并行实施期望数 量的扩增反应，其中在不同的纳升级反应环境中实施每个扩增反应。48. 如权利要求47所述的基板，其中配置所述多个纳升级反应环境，以在不对所述基板 进行进一步修饰的情况下，并行实施期望数量的扩增反应。49. 如权利要求46-48中任一项所述的基板，其中所述多个纳升级反应环境与任何微流 体通道或纳流体通道不存在流体连通。50. 如权利要求46-49中任一项所述的基板，其中每个纳升级反应环境具有不大于约 12nL的体积。51. 如权利要求46-49中任一项所述的基板，其中每个纳升级反应环境具有不大于约 20nL的体积。52. 如权利要求46-51中任一项所述的基板，其中配置每个上样区，以经由单次移液操 作将包含稀释的细胞的溶液上样至所述多个纳升级反应环境。53. 如权利要求46-52中任一项所述的基板，其中每个反应环境包含多个随机多聚物和 链置换聚合酶。54. 如权利要求53所述的基板，其中所述多个多聚物包含六聚物。55. 如权利要求46-54中任一项所述的基板，其包括至少3个上样区。56. 如权利要求46-55中任一项所述的基板，其中每个上样区包括至少10个纳升级反应 环境。57. 如权利要求46-55中任一项所述的基板，其中每个上样区包括至少100个纳升级反 应环境。58. 如权利要求46-57中任一项所述的基板，其还包括配置以检测每个所述反应环境中 的扩增-检测部分的检测器。59. 如权利要求46-58中任一项所述的基板，其还包括配置以从单个反应环境中回收扩 增的核酸的纳升级移液器。60. 如权利要求46-59中任一项所述的基板，其中配置所述纳升级反应环境，以使将包 含单细胞或其部分的溶液上样至上样区之后，至少99%的反应环境包含不多于一个细胞的 基因组。61. 如权利要求46-60中任一项所述的基板，其中基本上每个反应环境包含不多于一个 细胞的基因组，并且其中基本上每个包含基因组的反应环境还包含所述基因组的多个扩增 子。62. 如权利要求61所述的基板，其中所述多个扩增子包含基本无偏差的基因组覆盖度。63. 如权利要求46-62中任一项所述的基板，其中所述多个扩增子包含不多于约100皮 克-约10纳克的DNA。64. 如权利要求53-63中任一项所述的基板，其中所述链置换聚合酶包括phi29聚合酶。65. 如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述链置换聚合酶包括phi29聚合酶。
【专利摘要】本文提供用于基本无偏差的基因组扩增的方法和制成品。一些实施方案包括产生单细胞基因组的基本无偏差的扩增文库的方法。一些实施方案包括通过多链置换扩增(MDA)产生基本无偏差的基因组扩增的方法。一些实施方案包括用于基本无偏差的扩增多个单细胞中每个细胞的基因组的基板。
【IPC分类】C40B40/06
【公开号】CN105492668
【申请号】CN201480030827
【发明人】杰夫·戈莱, 张鹍
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2014年5月28日
【公告号】EP3004433A1, US20160138013, WO2014193980A1