无偏差的扩增 (图9A-9B)，但是根据本文的一些实施方案，在覆盖度分布方面MIDAS显示出更低的变异性， 使得它更适于用较少的测序投入进行CNV检出。此外，不像MIDAS，MALBAC还未在单细菌细胞 基因组测序所需的飞克水平的DNA输入中被证明。最后，由于使用的DNA聚合酶的差异， MALBAC的错误率大约为MDA的错误率100倍。
[0063] MIDAS可向研究者提供用于多种其它应用的强有力的工具，包括哺乳动物基因组 的高覆盖度的端对端的单体型分析或者在诱导多能性或干细胞分化过程中，在单细胞水平 研究新的CNV事件33 HDAS可允许以相对较低的价格对多个有机体进行有效的高通量测序。 这一新技术会帮助推进单细胞基因组学，增强我们鉴定多细胞有机体的多样性的能力，以 及导致不同环境中的数千种新的有机体的发现。 实施例
[0064] 方法
[0065]关于实施例1-5,使用下述方法。技术人员会理解，根据本文的一些实施方案，下述 方法可以被容易地使用或采用或改进：
[0066]微孔阵列制造
[0067]用聚二甲硅氧烷(PDMS)制造微孔阵列。每个阵列为7mmX7mm，每个载玻片具有2行 8阵列，每个阵列有156个微孔。单独的微孔的直径为400μπι，深度为lOOum(~12nL体积），并 且以蜂窝模式排列以使孔之间的空间最小化。为了制造所述阵列，首先在UC San Diego的 Nan〇3设备上利用软光刻技术制备SU-8模具。接下来，将比例为10:1的多聚物与PDMS的固化 剂混合物倒入模具。最后，将PDMS脱气并在65°C固化3小时。
[0068] 细菌以及神经元准备
[0069]过夜培养大肠杆菌K12MG1655,在指数期收集并用PBS洗涤三次。定量之后，将溶液 稀释至10个细胞AiL。如先前所述的分离人神经元核29'34,并在冰的70%乙醇中固定。用针对 NeuN的单克隆小鼠抗体（1:100稀释）（Chemicon，Temecula，CA)和AlexaFluor 488山羊抗鼠 IgG二抗（1:500稀释）（Life Technologies，San Diego，CA)标记核。用含有碘化丙啶（50ug/ ml) (Sigma，St · Louis，M0)、50ug/ml RNase A(Sigma)以及鸡红细胞核的（Biosure，Grass Valley，CA)的PBS溶液将核复染。用Becton Dickinson FACS-Aria II(BD Biosciences， San Jose，CA)对通过碘化丙啶荧光测定的位于G1/G0细胞周期峰的核进行电子门控，并基 于NeuN+免疫反应性进行选择性收集。
[0070] 细胞接种、裂解以及多重置换扩增
[0071] 在使用之前，首先将不含DNA或酶的所有试剂暴露于紫外光中10分钟。用氧等离子 体处理PDMS载玻片以使它们为亲水性的，并确保随机接种细胞。然后用含有1 %的牛血清白 蛋白（BSA) (EMD Chemicals，Bill erica，MA)的磷酸盐缓冲液（PBS) (Gibco，Grand Island， NY)处理载玻片30分钟，并用PBS洗涤3次以防止DNA附着于PDMS。在接种细胞之前，将载玻片 在真空中完全干燥。将细胞稀释至10个细胞的浓度，并向每个阵列中加入3yL细胞稀释 液(每个阵列总共30个细胞）。
[0072]首先，为了验证细胞接种符合泊松分布，将细胞用1 X SYBR绿染色并在荧光显微镜 下观察。用SEM成像进一步确认合适的细胞分布。对于SEM成像，将铬喷射至接种的细胞上， 持续6秒以增强传导性。注意细胞接种成像仅用于确认理论上的泊松分布，其在实际的扩增 和测序实验过程中并不实施，因为可能会引入污染。
[0073] 接种之后，使细胞沉积于孔中，持续10分钟。然后用300U的lOOU/yL的ReadyLyse溶 菌酶江？1(^11廿6，1&1(1&〇11，11)裂解接种的细胞，并室温孵育10分钟，或者在层流净化罩中， 采用利用干冰砖和室温进行的51分钟的冷冻/融解周期裂解接种的细胞。裂解之后，向每个 阵列中加入4.5yL碱性裂解(ALS)缓冲液(400mM K0H、100mM DTT、10mM EDTA)，并在冰上孵 育10分钟。然后向每个阵列中加入4.5Λ中和(NS)缓冲液(666mM Tris-HCl、250mM HCL)。加 入11.2yL MDA预混液（1 X缓冲液、0.2 X SYBR绿I、ImM dNTP、50μΜ巯基化随机六聚体引物、 8U phi29聚合酶、Epicentre、MadiSOn、WI)，然后用矿物油覆盖阵列。接下来将载玻片转移 至显微镜的载物台，所述显微镜载物台位于设置为30°C的自定义温度和湿度受控的培养箱 内。利用488nm的滤光片，以30分钟的间隔拍摄图片，持续10小时。
[0074]图像分析
[0075]用自定义Matlab脚本分析图像以减去背景荧光。由于向MDA预混液中添加了SYBR 绿，因此期望阳性扩增在488nm滤光片下的荧光会随时间增加。如果观察到荧光孔具有荧光 随时间增加的数字特征(每个阵列大约10-20个孔），则保留该阵列。如果没有孔发出荧光， 则扩增失败，并停止进一步的实验。可选地，如果大部分的孔发出荧光，则认为该阵列被污 染，并类似地停止后续分析。如果2个相邻的孔发出荧光，则两个都不被提取，因为每个孔中 存在多个细胞的可能性更高(如在此情况下，接种可能是不均匀的）。
[0076]扩增子提取
[0077] 在加热的条件下，将1mm外径的玻璃移液管（Sutter，Novato，CA)拉至~30um的直 径，弯至45度角，将其用5丨811^&^6(5丨81]^，51:丄〇11丨8，]\10)包被，并用(1!12〇洗涤3次。
[0078]利用上文所述的自定义Matlab脚本鉴定阳性扩增的孔。利用数字显微操作系统 (Sutter，N〇vat〇，CA)进行扩增子提取。将玻璃移液管置于显微操作器内并移动至目标孔上 方。将显微镜的滤光片调至明视野，并使移液管降至孔内。缓慢施加负压，并观察到孔的内 容物进入移液管。然后将滤光片调回至488nm以确保所述孔不再发荧光。将扩增子置于lyL dH 20 中。
[0079] 扩增子定量
[0080] 为了定量微孔的扩增，在20yL的PCR管反应（1 X缓冲液、0.2 X SYBR绿I、ImM dNTP、 50mM巯基化随机六聚体引物、8U phi29聚合酶）中，利用MDA再次扩增0.5yL扩增子。利用 Ampure XP珠 (Beckman Coulter，Brea，CA)进行纯化之后，使用Nanodrop分光光度计定量第 二轮扩增子。然后将第二轮扩增子稀释至1即、10(^8、1(^8、]^8以及10(^8以产生扩增子梯 度。随后，在定量PCR仪中，利用MDA与所述扩增子梯度一起扩增剩余的0.5yL第一轮扩增子。 允许样品扩增至完成，并摘录每个扩增至0.5X的最大荧光所需的时间。然后可以内推最初 的扩增子浓度。
[0081 ]低输入文库构建
[0082]将1.5yL ALS缓冲液加至提取的扩增子中以使DNA变性然后室温孵育3分钟。然后 在冰上加入1.5yL NS缓冲液以中和溶液。向变性的扩增子中加入10U的DNA聚合酶I (Invi trogen，Car lsbad，CA)以及250纳克未修饰的随机六聚体引物、ImM dNTP、1 X Ampligase缓冲液(Epicentre，Madison，Wi)和1 XNEB缓冲液2(NEB，Cambridge，ΜΑ)。将溶液 在37°C孵育1小时，允许第二条链合成。加入1U的Ampligase以封闭缺口，并且首先将反应物 在37°C孵育10分钟，然后在65°C孵育10分钟。利用标准的乙醇沉淀净化反应物，并用4yL水 洗脱。
[0083] 用1 X TE缓冲液和甘油将Nextera转座酶(Epicentre，Madison，WI)稀释100倍。添 加 lyL稀释的酶以及1 X tagment DNA缓冲液之后，然后对洗脱的扩增子进行10yL转座酶反 应。将用于哺乳动物的反应在55°C孵育5分钟，将用于细菌细胞的反应在55°C孵育1分钟。向 每个样品中添加〇. 05U蛋白酶(Qiagen，Hilden，Germany)以使转座酶失活;将蛋白酶反应在 50°CfP?育 10分钟，然后在65°CfP?育20分钟。添加5U Exo minus Klenow(Epicentre， Madison，WI)和ImM dNTP并在37°C孵育15分钟，然后在65°C孵育20分钟。实施双阶段定量 PCR(two stage quantitative PCR)，第一阶段利用1 XKAPA Robust 2G预混液（Kapa Biosystems，Woburn，ΜΑ)、10μΜ适配子1、10μΜ条形码标记的适配子2进行，第二阶段利用1 X ΚΑΡΑ Robust 2G预混液、10μΜ Illumina引物 1、10μΜ Illumina引物2以及0.4XSYBR绿I进 行，并且在扩增曲线达到其平台期之前停止反应。然后利用Ampure XP珠，以1:1的比率清理 反应。6%的PAGE凝胶证实了成功的标签化反应。
[0084] 细菌基因组的定位以及从头组装
[0085] 选择大小为300-600bp范围内的细菌文库，并且利用100bp的双端读取在Illumina 基因组分析仪Iix、Illumina HiSeq或Illumina MiSeq中进行测序。将大肠杆菌数据定位于 参考基因组，以及将其进行从头组装。对于定位分析，利用默认的Bowtie参数，将文库作为 单端读取定位于参考大肠杆菌K12MG1655的基因组上。对污染进行分析，并利用SAMtools的 rmdup功能移除克隆读取。对于从头组装，首先将组合长度小于200bp的双端读取进行连接， 并作为单端读取进行处理。然后将所有剩余的双端读取以及新产生的单端读取进行质量修 剪。利用SPAdes 1、. 2.4.0实施从头组装。用kmer值21、33和55对校正读取进行组装。利用 BLAST将组装的支架定位于NCBI nt数据库，并且利用MEGAN35使有机体分布可视化。从组装 物中移除明显的污染物(例如人），并且利用QUAST 36对组装物进行分析。利用RAST37和KAAS38 对剩余的重叠群进行注释。
[0086]实施例1 :MIDAS在微孔中实施大规模并行聚合酶克隆
[0087] 为了实施"刚好足够"的扩增并因此限制来自高度并行方式的MDA的指数扩增偏差 的影响，我们设计并制造了大小类似于标准显微镜载玻片的微孔阵列。优化微孔阵列的格 式，包括孔的大小、样式以及间隔，以实现有效的孔上样、最佳的扩增收率以及便利的DNA提 取。每个载玻片包含16个阵列，每个阵列包含156个直径为400μηι的微孔，该载玻片允许16个 单独的异质性细胞群进行并行扩增（图1Α)。每个阵列每一步的所有液体操作步骤(细胞接 种、裂解、DNA变性、中和以及添加扩增预混液)仅需要一个移液栗，这极大地减少了数百个 扩增反应所需的劳动。由于每个微孔的体积为12nL，因此试剂花费比传统方法少1000倍。为 了确保每个反应器仅包含一个单细胞，我们以大约每10个孔1个细胞的密度使微孔负载不 足，以保证不多于0.5%的孔包含多于1个细胞。将剩余的空孔用作内部阴性对照，以允许易 于检测以及消除污染样本。通过扫描电子显微镜确认微孔中合适的微生物细胞接种（图 1Β)〇
[0088] 将细胞群接种至每个微孔阵列之后，在温度和湿度受控的室中，我们以~12nL的 反应体积对接种的单细胞实施受限的多重置换扩增(MDA)(图1C)。我们利用SYBR绿I以利用 落射荧光显微镜使扩增子的增长实时可视化(图5)。观察到扩增子在整个阵列的随机分布， 其中大约10%的孔包含扩增子，还确认了单个微孔内的并行、局部扩增以及单细胞的随机 接种 2()。由于贯穿所有微孔的荧光信号统一增加，因此容易检测外源性污染，这允许容易地 移除受污染的样品。在微孔中进行扩增之后，我们采用显微操作系统以从单个孔中提取扩 增子用于测序（图1C)。该步骤中的荧光监测确保了仅单孔被提取，用于分析（图6A-6B)。利 用实时MDA 1，我们估计提取的扩增子的质量范围为500皮克-3纳克。
[0089]为了从纳克级的DNA扩增子中构建Illumina测序文库，我们利用了基于Nextera Tn5转座酶文库构建试剂盒的改进方法。先前的研究已经表明可使用仅仅10皮克的基因组 DNA来制备基于Nextera转座酶的文库21。然而，标准的Nextera方案不能从MDA扩增子中产生 高度复杂的文库，导致基因组覆盖度较差(数据未显示）。为了解决这一问题，我们首先利用 随机六聚物以及DNA聚合酶I将超支化的扩增子转变为无支链的双链DNA分子，以允许利用 Nextera?体外转座方法有效地构建文库（图1D)。此外我们利用小的反应体积以进一步增加 Nextera文库构建的效率21。
[0090] 因此，利用根据本文的一些实施方案的基本无偏差的扩增产物构建了测序文库。
[0091] 实施例2:MIDAS从单大肠杆菌细胞中有效地产生了几近完全的基因组组装。
[0092] 作为概念证明，我们对三个单MG1655大肠杆菌细胞进行MIDAS，并对每一个都进行 了大约2-8百万个之间的长度为100bp的双端Illumina测序读取分析，相当于87 X至364 X 之间的基因组覆盖度。我们首先将读取定位于参考大肠杆菌基因组，其能够以>1X的覆盖 度恢复94%-99%之间的基因组。然后我们利用SPAdes实施基因组的从头组装 22。我们能够 组装88%-94%之间的大肠杆菌基因组（图2)，其中N50重叠群大小为2，654-27，882bp，且最 大的重叠群的长度为18,465-132，037bp。超过80 %的组装的碱基被定位至大肠杆菌，剩余 的来自常见的MDA污染物，如代尔夫特菌属(Delftia)和食酸菌属(Acidovorax)(图7、表1)。 我们利用RAST以及KAAS注释服务器对基因组进行注释。在组装中，超过96%的大肠杆菌基 因被部分或完全覆盖。也存在主要的生物合成通路，包括糖酵解和三羧酸循环。此外，也覆 盖了氨基酸合成通路以及tRNA发展通路。因此，MIDAS能够用非常少的测序从单细胞组装很 大一部分的大肠杆菌基因组。
[0093]作为对照，我们还利用传统的管内MDA方法对一个大肠杆菌细胞进行了扩增和测 序，并控制反应时间以将扩增收率限制在纳克水平。一部分对照扩增子在第二反应中进一 步扩增至微克水平。利用传统的剪切和连接方法将两种对照扩增子转换进测序文库。我们 发现限制扩增收率导致扩增偏差降低，即使对于管内扩增而言。然而，当与两种对照反应中 的任一种相比时，MIDAS的扩增偏差降低水平显著（图SAIDhMIDAS还能够比基于传统MDA 的方法恢复更大部分的基因组。事实上，与之前公开的最完全的单大肠杆菌基因组数据集： 相比，MIDAS能够用比基于传统MDA的方法少3-13倍的测序投入(~90-400 X与~1200 X )回 收多50%的大肠杆菌基因组。该结果证明MIDAS为从未经培养的单细胞组装全细菌基因组 提供了更有效以及更合算的方法。
[0094]实施例3:MIDAS能够鉴定单成人神经元中的小的拷贝数变异。
[0095] 考虑到通过基于微孔的聚合酶克隆实现的高度统一的基因组覆盖度，接下来我们 将MIDAS应用于描述单哺乳动物细胞中的拷贝数变异特征。人脑更高的认知功能由神经元 和神经胶质的复杂网络所支持。一直认为人脑中的所有细胞共享相同的基因组。在不受任 何特定理论约束的情况下，最近的证据显示由于非整倍性& 26、活跃的反转录转座子27,28以 及其它DNA含量变化29,单个神经元具有不同的基因组。然而，还未在单一基因组规模最终证 明单个神经元中体细胞遗传变异的存在。为了证明MIDAS作为研究单一原代人神经元中拷 贝数变异的平台