极的表面从而得到了一种电化学免疫传感器，使用该电化学免疫传 感器可以实现对甲胎蛋白、癌胚抗原和前列腺特异性抗原的同时检测，并且具有较低的检 出限、较宽的检测范围和良好的重现性。
[0033] 实验证明：利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球电化学免疫探针同时检 测不同浓度的甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)和前列腺特异性抗原（PSA)，其检测线性范 围均为 0· 01-100ng/mL。检出限分别为 0· 01ng/mL，0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明一实施例制备的㈧海藻酸镉纳米微球的透射电镜图片，⑶海藻 酸铅纳米微球的透射电镜图片，（C)海藻酸铜纳米微球的透射电镜图片，（D)海藻酸镉纳米 微球的扫描电镜图片，（E)海藻酸铅纳米微球的扫描电镜图片，（F)海藻酸铜纳米微球的扫 描电镜图片；
[0035] 图2为利用制备的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不 同浓度的AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓 度对数（C)、电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。从图中可以看出该免疫传感器对AFP、 CEA和PSA的检测线性范围均为0. 01-100ng/mL。其检出限分别为，0. 01ng/mL、0. 0086ng/ mL 和 0· 0075ng/mL。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0037] 实施例1 :
[0038] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0039] (1)将2. 0g曲拉通，1. 0g正己醇，3. 0g正辛烷，1. 5mL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0040] (2)将2. 0g曲拉通，L 0g正己醇，3. 0g正辛烷，与(λ 5M L 5mL的CdCl2水溶液、 Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液2。
[0041] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应4h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球；透射电镜观察得到的海藻酸镉， 海藻酸铅以及海藻酸铜纳米微球的形貌如图1A、1B和1C所示。扫描电镜观察得到的海藻 酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的形貌如图1D、1E和1F所示。
[0042] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0043] 2. 1被检测样品：人血清
[0044] 2. 2 方法
[0045] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0046] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用10% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0047] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0048] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0049] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0050] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0051] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0052] 3、结果
[0053] 对血清样品的检测结果如下表1所示：
[0054] 表 1
[0055]
[0056] 实施例2 :
[0057] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0058] (1)将2. 5g曲拉通，1. 5g正己醇，3. 5g正辛烷，2. OmL 1. 5% (w/w)的海藻酸钠水 溶液混合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0059] (2)将2. 5g曲拉通，L 5g正己醇，3. 5g正辛烷，与L 0M 2. OmL的CdCl2水溶液、 Pb (N03)2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌1小时制备成均匀的微乳液2。
[0060] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应5h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。
[0061] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0062] 2. 1被检测样品：人血清
[0063] 2. 2 方法
[0064] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0065] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用12% (w/w)的戊二醛水溶 液处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0066] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0067] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0068] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0069] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0070] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0071] 3、结果
[0072] 对血清样品的检测结果如下表2所示，：
[0073] 表 2
[0074]
[0075] 实施例3 :
[0076] 1、海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球的制备
[0077] (1)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烧，1. OmL 1. 5%的海藻酸钠水溶液混 合搅拌45min制备成均匀的微乳液1。
[0078] (2)将1. 5g曲拉通，0· 5g正己醇，2. 5g正辛烷，与(λ 75M L OmL的CdCl2水溶液， 或Pb (N03) 2水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30min制备成均匀的微乳液2。
[0079] (3)将微乳液1逐滴加入微乳液