2中，室温下搅拌反应3h，产物离心，沉淀用去离 子水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球。
[0080] 2、利用海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球制备免疫探针及其免疫性能实 例：
[0081] 2. 1被检测样品：人血清
[0082] 2. 2 方法
[0083] (1)海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用去离子水洗涤、并分散；
[0084] (2)将海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别用8% (w/w)的戊二醛水溶液 处理活化氨基，离心，沉淀用去离子水洗涤、分散；
[0085] (3)室温下，将lmL含有活化的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球的溶液分 别与100 μ L，lmg/mL的AFP、CEA和PSA抗体偶联，离心除去上清液；
[0086] (4)沉淀加入lmL 5%的牛血清白蛋白封闭1小时，以消除非特异性吸附，离心去 除上清液。
[0087] (5)沉淀用去离子水洗涤，得到的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探 针分散到lmL去离子水中，制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜免疫探针于4°C储存。
[0088] (6)玻碳电极用石墨烯-金纳米材料修饰后，滴涂20 μ L 200 μ g mL 1的AFP、CEA 和PSA的捕获抗体混合溶液，于4°C孵化过夜，用0. 01M pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉未偶 联的抗体。然后，在电极上滴涂80μ L，5%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异 性吸附。电极用0. 01Μ，pH = 7. 3的磷酸缓冲液将过量牛血清白蛋白冲洗后用人血清在37°C 下孵育超过40min。未反应的人血清使用0. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉，在37°C 下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40 分钟。然后，免疫传感电极用〇. 01M，pH = 7. 3的磷酸缓冲液清洗掉过量的免疫探针。免疫 反应完成后，在〇. 2M，pH = 5. 0的的醋酸缓冲溶液中，用差分伏安法检测电流响应信号。
[0089] 同时采用传统ELISA方法做平行检测试验，以说明采用本发明方法与传统ELISA 方法测定结果的符合程度。
[0090] 3、结果
[0091] 对血清样品的检测结果如下表3所示：
[0092] 表 3
[0093]
[0094] 实施例4 :本发明的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的检测线 性范围及检出限的测定
[0095] 1、海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针的制备：
[0096] 按照实施例1的方法制备海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针。
[0097] 2、免疫传感器构建过程：
[0098] 20 μ L 200 μ g ·ιΛ 1的AFP、CEA和PSA的捕获抗体混合溶液在4°C条件下在多孔钼 修饰的玻碳电极上孵化过夜。电极表面多余的抗体用〇. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉。然后， 使用150μ L，2%的牛血清白蛋白溶液封闭1小时，以消除非特异性吸附。电极用0. 1M，pH =7. 3的PBS过量牛血清白蛋白冲洗后用浓度分别为0. 01，0. 05, 0. 1，0. 5, 1，5, 10, 50, 10 Ong · mL 1的AFP、CEA或PSA抗原混合溶液在37°C下孵育超过40min。未反应的抗原使用 0. 1M，pH = 7. 3的PBS清洗掉，在37°C下，与以等比例混合的三种海藻酸镉、海藻酸铅和海 藻酸铜纳米微球免疫探针孵育超过40分钟。然后，免疫传感电极用0. 1M，pH = 7. 3的PBS 清洗到过量的免疫探针。免疫反应完成后，以0. 1M，pH = 6. 5的PBS为检测液，用方波伏安 法检测电流响应信号。
[0099] 3、结果
[0100] 图2为海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针同时检测不同浓度的 AFP、CEA和PSA的差分脉冲伏安图（A)、电流与AFP浓度对数（B)、电流与CEA浓度对数（〇、 电流与PSA浓度对数（D)的线性关系图。
[0101] 从图中可以看出该免疫传感器对AFP、CEA和PSA的检测线性范围均为 0· 01-100ng/mL。其检出限分别为，0· 01ng/mL、0. 0086ng/mL 和 0· 0075ng/mL。
【主权项】
1. 一种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于通过以下方法制备得 到： (1) 将l-3g曲拉通，0. 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烷，l-2mL海藻酸钠水溶液混合搅拌 30-90min制备成均匀的微乳液1 ; (2) 将l-3g曲拉通，0· 5-1. 5g正己醇，4-6g正辛烧，与l-2mL的CdCl2水溶液、Pb (N03) 2 水溶液或CuCl2水溶液混合搅拌30-90min制备成均匀的微乳液2 ; (3) 将微乳液1逐滴加入微乳液2中，室温下搅拌反应l-6h，产物离心，沉淀用去离子 水清洗，即得海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球。2. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 (1)所述的海藻酸钠的水溶液的质量百分比浓度为1-2%。3. 如权利要求1所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球，其特征在于：步骤 ⑵所述的CdCl2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，Pb (N03) 2的水溶液的浓度为0. 1-2. 0M，CuCl2 的水溶液的浓度为〇. 1-2. 0M。4. 权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球在制备海藻酸 镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针中的应用。5. -种海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在于通过以下方法 制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球分别与抗体溶液偶联， 离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。6. 如权利要求5所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针，其特征在 于：步骤（2)中所用戊二醛的质量百分比浓度为5-15%。7. 权利要求5-6任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球免疫探针在制 备电化学免疫传感器中的应用，优选的，按照权利要求5的方法分别制备偶联不同种抗体 的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针，将制得的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻 酸铜纳米微球免疫探针固定在电极的表面，得到能够同时对三种肿瘤标志物进行检测的电 化学免疫传感器。8. -种能够同时实现对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行检测的电化学免疫传感器，其 特征在于通过以下方法制备得到： (1) 将权利要求1-3任一项所述的海藻酸镉、海藻酸铅或海藻酸铜纳米微球用去离子 水洗涤、分散； (2) 将海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球用戊二醛水溶液处理活化氨基，离心， 沉淀用去离子水洗涤、分散； (3) 室温下，将活化的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球分别与抗肿瘤标志物 CEA、AFP或PSA的抗体溶液偶联，离心除去上清液； (4) 沉淀用去离子水洗涤、分散后，得到的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免 疫探针于4°C储存。 (5) 通过免疫反应将制得的海藻酸镉，海藻酸铅和海藻酸铜纳米微球免疫探针固定在 电极的表面，即得。9.权利要求8所述的电化学免疫传感器在制备对肿瘤标志物CEA、AFP和PSA进行同 时检测的试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒及其制备方法和在制备电化学免疫探针中的应用。本发明通过在微乳液中用镉离子、铅离子或铜离子分别交联海藻酸钠制备了纳米级的海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜球形颗粒，且能产生可分辨电化学信号。本发明制备方法的特点是制备条件温和，无需外加信号物质即可直接用于标记。使用此海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒标记不同抗体制备的电化学免疫传感器，能够实现不分区的三靶标的同时检测。本发明的一种海藻酸镉、海藻酸铅和海藻酸铜纳米颗粒免疫探针，以及由其制备得到的电化学免疫传感器在免疫传感领域将具有广泛的应用前景。
【IPC分类】G01N33/543, G01N33/574, C08J3/14, C08L5/04
【公开号】CN105504314
【申请号】CN201410488196
【发明人】马占芳, 王子凤
【申请人】首都师范大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年9月22日