系列甲基化儿茶素单体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种利用吸附柱层析法W及Akta半制备高效液相色谱仪，纯化茶叶 中的甲基化儿茶素成分，制备系列甲基化儿茶素单体的方法。
【背景技术】
[0002] 很久W来，茶叶一直受到人们的喜爱。除了脸炙人口的的色、香、味之外，目前流行 病学与预防医学研究表明喝茶可W降低患肿瘤和屯、脑血管等疾病的风险。茶还具有抗氧 化、抗炎症、抗过敏和抗肥胖的生理功效。研究发现茶的风味与保健功能正是茶叶所特有的 茶多酪等具有生物活性的成分所赋予的。
[0003] 茶多酪是儿茶素(黄烧醇类）、花色素类(花青素和花白素）、花黄素类(黄酬与黄酬 类)等集于茶叶中的一群多酪复合物的总称。其中儿茶素占60-80%，分为醋型儿茶素和游 离型儿茶素，醋型儿茶素占儿茶素的70%左右。酪类物质早就被报道具有多种生理活性，尤 其是表没食子儿茶素没食子酸醋化GCG)。近几年研究发现一些特定的乌龙茶中含有另一种 儿茶素，即儿茶素的甲基化衍生物，W(-)-表没食子儿茶素3-0(3-0-甲基）没食子酸醋 化GCG3"Me)和(-)-表没食子儿茶素3-0(4-0-甲基)没食子酸醋化GCG4"Me)为主。目前关于 甲基化儿茶素生理功能的研究主要集中在对甲基化EGCG的抗过敏作用的研究方面，尤其是 对最常见的花粉过敏症具有显著的预防和抑制作用。在日本，部分富含甲基化EGCG的产品 已经进入商业发展阶段，在食品行业，饼干、口香糖、茶饮料等添加甲基化EGCG给食品行业 注入了新的卖点，得到了更多消费者的青睐。因此，甲基化儿茶素的研究至关重要，在学术、 生物学方面都具有非常重要的意义。
[0004] 目前，研究报道的甲基化儿茶素的体外合成主要有化学法和生物酶法。但是，化学 合成法中需要使用大量有机溶剂和各种基团保护剂，合成反应条件较为苛刻，专一性差，畐U 产物多，因此，化学合成不宜作为甲基化儿茶素的体外合成方法。体外酶法合成虽然专一性 强、反应条件溫和、安全性高，但目前甲基化儿茶素的体外转化研究均没有对合成反应物进 行分离纯化与结构解析，没有实现酶法合成产物的大量制备。
[0005] 从茶叶中直接提取甲基化儿茶素，由于其来源于天然产物，有着较好的安全性。从 食品工业角度看，必须考虑原料充足、方便、易得、无毒性、生产成本低等问题，因此，合理的 方法是从茶叶中直接提取甲基化儿茶素。一些中国产乌龙茶中甲基化儿茶素含量较高，结 合吸附柱层析法W及AKTA半制备高效液相色谱仪，可W制备系列甲基化儿茶素单体。
【发明内容】
[0006] 本发明的要解决的技术问题是W中国产乌龙茶作为原料，制备系列甲基化儿茶素 单体的方法，能够保证提取的产品纯度高、成本低、效率高、环境友好，且易于实现工业化生 产。为解决上述问题，本发明提供了一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，包 括如下工艺步骤：
[0007] 1)茶叶经热水提取，干燥得到粗提取物；
[0008] 2)采用特定的大孔树脂A处理粗提取物，先用水充分洗脱，去除色素和咖啡碱；
[0009] 3)接着用80%浓度的乙醇溶液洗脱大孔树脂A，收集洗脱液，经浓缩和干燥，得到 甲基化儿茶素含量> 20 %的组分1;
[0010] 4)采用Toyopearl HW-40S树脂处理组分1，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集不同 时间的洗脱液，经浓缩和干燥，分别得到纯度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3 ' Me;
[0011] 5)纯化后的EGCG3"Me和ECG3"Me经过高溫高压处理后，分别部分异构化为对应的 差向异构体GCG3" Me和CG3" Me;
[0012] 6)处理后的样品溶液，经过ΑΚΤΑ半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，经浓缩 和干燥，分别得到66〔6沪]^、6〔6沪]^、6〔6沪]^和〔6沪]^的单体物质。
[0013] 本发明所述工艺提取的甲基化儿茶素单体产品纯度均达到99% W上，大孔吸附树 脂的再生性能好，可W再生重复使用，洗脱剂乙醇无毒无害，也可W回收多次利用。本工艺 成本低、效率高、环境友好，易于实现工业化生产。
【附图说明】
[0014] 图1为EGCG3"Me的核磁共振氨谱图 [001引图2为ECG3"Me的核磁共振氨谱图
[0016] 图 3 为EGCG3" Me、ECG3" Me、GCG3" Me 和 CG3" Me 的 HPLC 图谱
【具体实施方式】
[0017] 1)粗提取物:茶叶经磨碎后，用热水浴浸提40min，液料比20:1，水浴溫度为95°C， 浸提之后在40-50°C下进行减压浓缩；
[0018] 2)大孔树脂A处理:选取大孔树脂A，用抑2.0-3.0的缓冲液平衡，上样液也调整成 与缓冲液同样的pH，儿茶素浓度为5mg/mL，上样流速为每小时1-2个柱床体积；
[0019] 3)乙醇溶液洗脱:先用水冲大孔树脂，至流出液无色为止，再换上80%浓度的乙醇 溶液进行洗脱，洗脱流速为每小时1 -2个柱床体积，收集洗脱液，在40-50°C下减压浓缩，得 到甲基化儿茶素含量> 20 %的组分1;
[0020] 4)Toyopearl册-40S树脂处理:选取的Toyopearl册-40S树脂上样组分1之后，用 80%的乙醇溶液洗脱树脂，流速为每小时1-2个柱床体积，收集不同时间的洗脱液，在40-50 。(:下减压浓缩，分别得到纯度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3"Me。
[0021] 5)高溫高压处理:得到的纯度大于95%的EGCG3"Me和ECG3"Me，溶解于适量去离子 水，在高溫（123°C ) W及高压(0.09-0.1 IMpa)条件下加热7分钟，使其部分异构化为对应的 差向异构体GCG3" Me和CG3" Me。
[0022] 6) AKTA半制备高效液相色谱仪进行分离纯化:得到的EGCG3" Me、ECG3" Me W及对 应的差向异构体GCG3"Me和CG3"Me，浓缩后上样至ΑΚΤΑ半制备高效液相色谱仪，用40%的甲 醇溶液洗脱色谱柱，流速为2mL/min。收集不同时间的洗脱液，分别得到EGCG3" Me、ECG3" Me、 GCG3"Me和CG3"Me的单体物质。
【主权项】
1. 一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，包括如下步骤： 1) 茶叶经热水提取，干燥得到粗提取物； 2) 采用特定的大孔树脂A处理粗提取物，先用水充分洗脱，去除色素和咖啡碱； 3) 接着用80 %浓度的乙醇溶液洗脱大孔树脂A，收集洗脱液，经浓缩和干燥，得到甲基 化儿茶素含量>20%的组分1; 4) 采用Toyopearl HW-40S树脂处理组分1，用80%浓度的乙醇溶液洗脱，收集不同时间 的洗脱液，经浓缩和干燥，分别得到纯度大于95 %的EGCG3" Me和ECG3" Me; 5) 纯化后的EGCG3"Me和ECG3"Me经过高溫高压处理后，分别部分异构化为对应的差向 异构体 GCG3" Me 和 CG3" Me; 6) 处理后的样品溶液，经过Akta半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，经浓缩和干 燥，分别得到66〔6沪]?6、6〔6沪]\16、6〔6沪]\16和〔6沪]\16的单体物质。2. 根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征 在于步骤1)中茶叶经磨碎后，用热水浴浸提40min，液料比20:1，水浴溫度为95°C，浸提之后 在40-50°C下进行减压浓缩。3. 根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征 在于步骤2)中选取对儿茶素存在选择性吸附的大孔树脂A，用抑2.0-3.0的缓冲液平衡，上 样液也调整成与缓冲液同样的pH，儿茶素浓度为5mg/mL，上样流速为每小时1-2个柱床体 积。4. 根据权利要求1所述的从一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特 征在于步骤3)先用水冲大孔树脂，至流出液无色为止，再换上80%浓度的乙醇溶液进行洗 脱，洗脱流速为每小时1-2个柱床体积，收集洗脱液，在40-50°C下减压浓缩，得到甲基化儿 茶素含量>20%的组分1。5. 根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征 在于步骤4)中选取的Toyopearl HW-40S树脂上样组分1之后，用80%的乙醇溶液洗脱树脂， 流速为每小时1 -2个柱床体积，收集不同时间的洗脱液，在40-50°C下减压浓缩，分别得到纯 度大于 95 % 的 EGCG3" Me 和 ECG3" Me。6. 根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征 在于步骤5)中得到的纯度大于95 %的EGCG3"Me和ECG3"Me，溶解于适量去离子水，在高溫 (123°C) W及高压(0.09-0.1 lMpa)条件下加热7分钟，使其部分异构化为对应的差向异构体 0〔6沪]?6和〔6沪]\16。7. 根据权利要求1所述的一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法，其特征 在于步骤6)中得到的66〔63"]?6、6〔63"]\16^及对应的差向异构体0〔63"]\16和〔63"16，浓缩后 上样至Akta半制备高效液相色谱仪，用40%的甲醇溶液洗脱色谱柱，流速为2mL/min，收 集不同时间的洗脱液，在40-50 °C下减压浓缩，分别得到EGCG3" Me、ECG3" Me、GCG3"Me和CG3" Me的单体物质。
【专利摘要】本发明公开了一种从乌龙茶中制备系列甲基化儿茶素单体的方法。包括如下步骤：以一种中国产乌龙茶为原料，经热水提取，干燥得到粗提取物。粗提取物经过大孔树脂A处理之后，得到甲基化儿茶素含量＞20％的组分1。组分1经过Toyopearl？HW-40S树脂处理之后，分别得到纯度大于95％的EGCG3”Me和ECG3”Me；纯化后的EGCG3”Me和ECG3”Me经过高温高压处理后，分别部分异构化为对应的差向异构体GCG3”Me和CG3”Me。处理后的样品溶液，经过半制备高效液相色谱仪进行分离纯化，分别得到EGCG3”Me、ECG3”Me、GCG3”Me和CG3”Me的单体物质。作为一种成本低、效率高、环境友好的制备工艺，本发明易于工业化生产，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C07D311/62
【公开号】CN105585550
【申请号】CN201610064213
【发明人】曾晓雄, 张鑫
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2016年1月28日