基于IL-15和IL-15Rαsushi结构域的调节因子的制作方法
【专利说明】基于IL-15和IL-1 SRasush i结构域的调节因子
[0001] 本国际专利申请要求于2013年8月8日提交的欧洲专利申请EP13003963.9的优先 权，该申请W引用的方式并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及新的"免疫细胞因子"（本文称之为调节因子(modulokine))，及其作为 药物的用途，特别是通过活化肿瘤浸润淋己细胞(TIL)来治疗癌症。
【背景技术】
[0003] 脊椎动物的免疫系统需要多种分子和细胞的相互作用来达到抗肿瘤的最佳免疫 响应。
[0004] 现在，宿主的抗肿瘤免疫主要受TIL的影响(GALON等，Science，vol. 313，p :1960-1964,2006)。事实上，许多证据表明TIL受肿瘤细胞的抑制调节。
[0005] 为了使所述TIL"再活化"，已经设想了多种策略和目标。运些策略基于i)TIL免疫 抑制受体(如〇化-44、？〇-1、8化4、1^\63齡￥0?2、4001?424或抑制性1(11〇的抑制，从而通过防止 信号下调来促进免疫活化;或基于ii)TIL共刺激受体(如CD40、4-lBB、0X-40或糖皮质激素 诱导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)相关蛋白（GITR))的刺激，从而促进T细胞和/或NK细胞的 活化。
[0006] 尽管所述疗法提供了一些有前途的结果，但是运些策略的效力似乎是有限的。多 数情况下，仅有少数比例的群组(cohort)显示出了恢复的TIL响应。
[0007] 为了获得增强的效力，现设想将上述策略与其他药物或调节剂组合。
[000引因此，发明人尝试将上述策略与抗-PDl抗体与公开在专利申请W02007/046006中 的调节剂组合。
[0009] 结果表明，上述组合不能恢复显著部分（即约20%)的自肾细胞癌(RCC)患者中分 离的TIL。
[0010] 发明概述
[0011] 现在，发明人还尝试了另外一种组合，即将相同的调节剂与相同的抗体融合从而 提供一种新型的免疫细胞因子，称为"调节因子"。惊奇的是，与前述组合相比，运种组合提 供了强的TIL再活化，其中观察到了绝大多数的TIL(即约80%)的再活化。
[0012] 运种强的协同作用能够想到新的疗法。
[0013] 因此，本发明设及一种免疫细胞因子，所述免疫细胞因子包含：
[0014] A)缀合物，和
[0015] B)通过共价键直接或间接连接至所述缀合物的免疫调节抗体或其片段，
[0016] 其中，所述缀合物包含：
[0017] (i)包含白细胞介素15或其衍生物的氨基酸序列的多肤，和
[0018] (ii)包含IL-ISRa的sushi结构域或其衍生物的氨基酸序列的多肤。
[0019] 第二方面，本发明设及编码上述免疫细胞因子的核酸。
[0020] 第=方面，本发明提供包含上述核酸的载体。
[0021] 第四方面，本发明设及采用上述多核巧酸或载体遗传工程化的宿主细胞。本发明 还设及一种生产表达根据本发明的免疫细胞因子的遗传工程化宿主细胞的方法，所述方法 包括如下步骤：（i)体外或离体引入上述核酸或载体至宿主细胞；（ii)体外或离体培养遗传 工程化获得的重组宿主细胞，和（iii)可选地，选择表达和/或分泌所述免疫细胞因子的细 胞。
[0022] 在优选的实施方案中，所述遗传工程化宿主细胞是动物细胞，优选为C册细胞。
[0023] 第五方面，本发明提供一种药物组合物，该组合物包含最终与药学上可接受的媒 介物(carrier)结合的如上所述的免疫细胞因子、编码该免疫细胞因子的核酸、或包含所述 核酸的核酸载体。
[0024] 在优选的实施方案中，所述组合物包含其它治疗剂，优选为抗癌剂。
[0025] 第六方面，本发明设及用于治疗受试者的癌症的上述药物组合物。
[0026] 第屯方面，本发明设及产品，该产品含有：
[0027] (i)上述免疫细胞因子、编码所述免疫细胞因子的核酸序列、或包含运种核酸序列 的载体，和
[00%] (ii)治疗剂，优选抗癌剂，
[0029] 作为用于治疗受试者的癌症的同时、单独或顺序使用的组合制剂。
[0030] 第八方面，本发明设及用于治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向所述受试者 施用上述药物组合物的步骤。
[0031] 最后一个方面，本发明设及用于治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试 者同时、单独或顺序地施用治疗有效量的如下物质的步骤：
[0032] (i)上述免疫细胞因子、编码所述免疫细胞因子的核酸序列、或包含运种核酸序列 的载体，和
[0033] (ii)治疗剂，优选抗癌剂。
【附图说明】
[0034] 图1示出了PD-I、Tim-3和IL-ISRa在源自患者A(A)和患者B(B)的TIL中的表达；
[0035] 图2示出了由抗-PD 1抗体化BAT )、RLI、RLI和HBAT的组合(RLI +皿AT)或本发明的调 节因子化BAT-RLI)诱导的肿瘤浸润淋己细胞(TIL)的再活化。
[003引发明详述
[0037]术语"免疫细胞因子"是指包含通过共价键直接或间接连接至细胞因子或其衍生 物的抗体或其片段的分子。所述抗体和所述细胞因子可通过连接肤连接。 陶]本发明的免疫细胞因子的缀合物
[0039]术语"白细胞介素15"为其在本领域的一般含义，是指具有类似于IL-2的结构的细 胞因子(GRABSTEIN 等，Science，vol. 264(5161 )，p :965-968,1994)。运种细胞因子也被称为 IL-15、IL15或MGC9721。运种细胞因子和IL-2共享许多生物活性，且发现它们结合相同的促 红细胞生成素受体亚基。因此，化-15和IL-12可W竞争相同的受体，从而负调节彼此的活 性。已经证实，比-15调节T细胞和自然杀伤细胞的活化和增殖，且证明CD8+记忆细胞的数量 由IL-15运种细胞因子和IL-2之间的平衡来控制。如实施例中所公开的，化-15的活性可W 通过测定其对kit225细胞系的增殖诱导来测量化ORI等，Blood，vol. 70(4)，p :1069-72, 1987) O
[0040] 对于kit225细胞系的增殖诱导，所述IL-15或其衍生物具有人白细胞介素-15的活 性的至少10%，优选地至少25%，更优选地至少50%。
[0041] 所述白细胞介素15为哺乳动物白细胞介素15,优选地为灵长类动物白细胞介素 15,更优选地为人白细胞介素15。
[0042] 本领域技术人员可W简单地识别哺乳动物白细胞介素15。作为实例，可W引用源 自野猪（Sus scrofa)(登录号：ABF82250)、褐家鼠（Rattus norvegicus)(登录号：肥_ 037261)、小家鼠（Mus musculusK登录号：NP_032383)、牛（Bos Taurus)(登录号：NP_ 776515)、家兔（Oiyctolagus 州ni州lus)(登录号：NP_001075685)、绵羊（Ovies aries)(登 录号：NP_001009734)、家猫（Felis catus)(登录号：NP_001009207)、食蟹猴（Macaca fascicularis)(登录号：BAA19149)、智人（登录号：NP_000576)、恒河猴(Macaca Mulatta) (登录号：肥_〇〇1〇38196)、±拨鼠（Cavia porcel Ius)(登录号：肥_001166300)或绿猴 (Qilorocebus sabaeus)(登录号:ACI289)的白细胞介素 15。
[00创本文所用术语"哺乳动物白细胞介素15"是指共有序列SEQ ID NO: 1。
[0044] 本领域技术人员可W简单地识别灵长类动物白细胞介素15。作为实例，可W引用 源自野猪(登录号:ABF82250)、家兔(登录号:肥_001075685)、食蟹猴(登录号:BAA19149)、 智人(登录号:NP_000576)、恒河猴(登录号:NP_001038196)或绿猴(登录号:ACI289)的白细 胞介素15。
[0045] 本文所用术语"灵长类动物白细胞介素15"是指共有序列SEQ ID NO:2。
[0046] 本领域技术人员可W简单地识别人白细胞介素15,且所述人白细胞介素15是指氨 基酸序列沈Q ID NO:3。
[0047] 本文所用术语"白细胞介素15的衍生物"是指与选自SEQ ID N0:1、沈Q ID N0:2和 SEQ ID NO: 3的氨基酸序列具有至少92.5% (即对应于约10个氨基酸置换）、优选地至少 96 % (即对应于约5个氨基酸置换）、更优选地至少98.5 % (即对应于约2个氨基酸置换)或至 少99% (即对应于约1个氨基酸置换）同一性百分数的氨基酸序列。本领域技术人员根据其 自身的知识及本专利申请的教导可W简单地识别运类衍生物。作为运类衍生物的实例，可 W引用国际专利申请PCT WO 2009/135031中描述的那些。还应当理解的是天然的氨基酸可 W被化学修饰的氨基酸替换。通常，运种化学修饰的氨基酸增加多肤的半衰期。
[0048] 本文所用术语两个氨基酸序列之间的"同一性百分数"是指通过将进行比较的两 个序列的最佳比对获得的所述两个序列之间相同氨基酸的百分数，运一百分数是纯粹统计 学意义的且两个序列之间的差异被随机地分布于氨基酸序列中。本文所用"最佳比对"或 "最优比对"是指所确定的同一性百分数(参见下文)最高的比对。两个氨基酸序列之间的序 列比较通常是通过比较事先已经根据最佳比对来比对过的序列而实现的；运一比较在片段 比较中实现，W便识别和比较局部区域的相似性。除通过手动方式之外，实施比较的最佳序 列比对可W通过采用由Smith和Waterman开发的局部同源算法(Ad.App.Math. ,VO1.2,P: 482,1981 )、由Neddleman和Wunsch开发的全局同源算法（J .Mol. Biolvol. 48 ,P : 443 , 1970)、由Pearson和Lipman开发的相似法（Proc .化tl .Acd. Sci . USA, vol. 85 ,P : 2444 , 1988) 、使用运种算法的计算机软件(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、邸STFIT、BLAST P、BLAST N、FASTA、TFASTA,Genetics Computer Group ,575Science Dr.,Madison,WI USA)、MUSCIE多重比对算法化dgar,Robert C. ,Nucleic Acids Research，vol.32，p: 1792， 2004)或化USTAL(G0UJ0N等，Nucleic acids research，vol.38,W695-9,2010)来实现。为了 获得最佳的局部比对，可W优选使用具有化OSUM 62矩阵的BLAST软件。两个氨基酸序列之 间的同一性百分数是通过比较最佳比对的两个序列确定的，所述氨基酸序列能够包含相对 于参考序列的添加或缺失，W便得到两个序列之间的最佳比对。通过W下方法来计算同一 性百分数:确定两个序列中相同位点的数量，用该数量除W比较的位点的总数，然后所得结 果乘WlOO,从而得到两个序列之间的同一性百分数。
[0049] 优选地，所述白细胞介素15的衍生物是IL-15激动剂或超激动剂。本领域技术人员 能够简单地识别化-15-激动剂或比-15-超激动剂。作为比-15-激动剂或化-15-超激动剂的 实例，可 W 引用国际专利申请 WO 2005/085282 或 Z 册等(J.Immunol.，vol.183(6)，p:3598-607,2009)中公开的那些。
[0050] 进一步优选地，所述IL-15激动剂或超激动剂选自包含下述或由下述组成的组： L4 加、1^456、5510、1^520、^20、爪26、^24、爪25、^2￥和^2?(参考人化-15的序列，569 10 N0:3)〇
[0051] 本文所用术语"化-15Ra的sushi结构域"具有其在本领域的一般含义，是指起始于 化-15Ra的信号肤之后的第一个半脫氨基酸残基(Cl),并终止于所述信号肤之后的第四个 半脫氨基酸残基(C4)的结构域。对应于IL-ISRa的胞外区域的一部分的所述sushi结构域是 其结合至比-15所必需的(肥I等，J. Immunol.，VOl. 167( 1)，p: 277-282，2001)。
[0化2] 所述IL-ISRa的sushi结构域或其衍生物具有人IL-ISRa的sushi结构域对人白细 胞介素-15的结合活性的至少10%，优选至少25%，更优选至少50%。所述结合活性可W通 过WEI等公开的方法(上述提及，2001)简单地确定。
[0053] 所述IL-ISRa的sushi结构域为哺乳动物IL-ISRa的sushi结构域，优选地为灵长类 动物IL-ISRa的sushi结构域，更优选地为人IL-ISRa的sushi结构域。
[0054]本领域技术人员可简单地识别哺乳动物IL-ISRa的sushi结构域。作为实例，可W 引用源自褐家鼠（登录号：Xt〇02728555)、小家鼠（登录号：EDL08026)、牛（登录号：Xt 002692113)、家兔（登录号：XP_002723298)、食蟹猴（登录号：ACI42785)、豚尾猴(Macaca nemestrina)(登录号：ACI42783)、智人（登录号：Q13261.1)、恒河猴（Macaca M