款冬花多糖的提取与纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药用植物加工领域，具体涉及款冬花多糖的提取与纯化方法。
【背景技术】
[0002]款冬花为菊科款冬的花蕾，性味辛温，具有润肺下气，化痰止嗽的作用。在医疗单位处方和民间验方、偏方等也多采用款冬花之治疗急慢性气管炎、肺结核等症。款冬花多糖具有抗氧化性、抗肿瘤、抗病毒、抗溃疡、抗突变、降血脂、降血糖、防衰老，调节机体免疫功能，增强免疫力等作用，可将款冬花多糖应用于食品、药品、保健品等领域，款冬花多糖的提取纯化有重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于，针对现有技术，提供款冬花多糖的提取与纯化方法。
[0004]为实现上述目的，本发明采取以下技术方案:款冬花多糖的提取与纯化方法包括以下步骤:
(1)粉碎、脱脂预处理:将款冬花花蕾在80°C的烘箱中烘12h后，将其粉碎，过100目筛，按Ig:1Oml的料液比添加95%乙醇溶液，回流脱脂2次，每次时间为2h，将提取液过滤，将滤饼中的乙醇挥干；
(2)预浸泡-超声-水提联合提取款冬花多糖:将预处理过的款冬花多糖与水按料液比18:15?221111的料液比混合，在30°(:下浸泡611，然后在60?70°(:下超声10?301^11后，水提2次，每次120?160min，收集提取液，并离心收集上清液，过滤后合并滤液，将滤液真空浓缩为原体积的八分之一，将浓缩后的滤液加入4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，干燥即得款冬花粗多糖；
(3)脱蛋白:将粗多糖溶于蒸馏水中，配制成10mg/ml的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入1.5?2.5%的质量浓度为111^/1111，？!1为7.0的木瓜蛋白酶溶液，置于55?65°(:下80?10min，加入Sevage试剂，经3000r/min均质机充分混合20min，在3000r/min离心1min，除去沉淀，取上清液再加入Sevage试剂，重复上述操作2次，在上清液中加入4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h，抽滤后真空干燥即得脱蛋白后多糖；
(4)脱色:将大孔树脂进行除杂、酸碱处理、干燥预处理，将脱蛋白后的多糖配置成2mg/ml的多糖溶液后，将大孔树脂和多糖溶液按Ig: 95?10ml的比例加入恒温振荡器中，振荡吸附6h，过滤即得脱色多糖；
(5)透析:将步骤(4)所得多糖配置成10mg/ml溶液，用自来水流动透析48h，再用蒸馏水透析24h，然后用4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，50 °C真空干燥即得款冬花多糖。
[0005]其中，所述的步骤(2)中超声功率为80?90w。
[0006]其中，所述的Sevage试剂为氯仿:正丁醇为4:1。
[0007]其中，所述的步骤(4)中，大孔树脂的预处理为:将大孔树脂用蒸馏水浸泡除去水溶性杂质剂及悬浮物，先用95 %乙醇浸泡24h，用蒸馏水水洗至无醇味且水液澄清，再用3倍树脂体积的3%稀盐酸溶液12h，用蒸馏水洗至中性，再用3倍树脂体积的3%强氧化钠溶液浸泡12h，用蒸馈水洗至中性后凉干。
[0008]其中，所述的大孔树脂为XD-5大孔树脂。
[0009]其中，所述的步骤(4)中，振荡吸附的条件为:温度25°C，恒温振荡器频率120次/
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[0010]进一步的，由于蛋白质的溶解性与多糖相似，因此，步骤(2)所得到的粗多糖存在一定量的蛋白质，需进一步纯化，进行脱蛋白处理。
[0011]进一步的，多糖中的蛋白质以纯糖链或者糖链与肽链的结合，形成的糖肽或糖蛋白，步骤(3)中脱蛋白主要去除游离蛋白。本发明采用木瓜蛋白酶处理，可降解更多的植物蛋白，降低多糖随凝胶物沉淀的损失。
[0012]进一步的，款冬花多糖提取液中含有较多的色素，不但影响多糖的色泽和纯度，还影响多糖的生物活性，在脱色方法中，大孔吸附树脂很难吸附糖类物质，而对色素有较好的吸附性，采用大孔树脂吸附色素脱色具有很好的脱色效果。
[0013]本发明的有益效果是:
1、本发明采用预浸泡-超声-水提联合提取款冬花多糖，预浸泡能使溶剂充分渗入到植物细胞壁，可提高提取率，超声的空化作用可加快细胞破壁，加快细胞中多糖的释放和溶出速度，超声波还使提取物与溶剂不断震荡，有助于多糖的扩散，再用热水提取，提高溶质溶出速率和提取率。
2、本法明采用木瓜蛋白酶与Sevage试剂联合脱蛋白，将蛋白质降解在沉淀去除，具有较高的蛋白脱出率和多糖保留率。
3、本发明采用大孔树脂法进行脱色，具有脱色效率高，多糖保留率高的优点。
4、本发明采用先用自来水透析，再用蒸馏水透析，减少蒸馏水的使用量，能将款多糖进一步除杂净化。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例，对本发明进一步的说明。
[0015]实施例1
[0016]款冬花的提取与纯化方法，包括以下步骤:(I)粉碎、脱脂预处理:将款冬花花蕾在80 0C的烘箱中烘12h后，将其粉碎，过100目筛，按Ig:1Oml的料液比添加95 %乙醇溶液，回流脱脂2次，每次时间为2次，将提取液过滤，将滤饼中的乙醇挥干；
(2)预浸泡-超声-水提联合提取款冬花多糖:将预处理过的款冬花多糖与水按料液比Ig: 20ml的料液比混合，在30 0C下浸泡6h，然后在60 °C下，超声功率为70w，超声1min后，水提2次，每次2h，收集提取液，并离心收集上清液，过滤后合并滤液，将滤液真空浓缩为原体积的八分之一，将浓缩后的滤液加入4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，干燥即得款冬花粗多糖；
(3)脱蛋白:将粗多糖溶于蒸馏水中，配制成10mg/ml的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加Al.5%的质量浓度为lmg/ml，PH为7.0的木瓜蛋白酶溶液，置于60 °C下10min，加入氯仿:正丁醇为4:1的Sevage试剂，经3000r/min均质机充分混合20min，在3000r/min离心lOmin，除去沉淀，取上清液再加入氯仿:正丁醇为4:1的Sevage试剂，重复上述操作2次，在上清液中加入4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h，抽滤后真空干燥即得脱蛋白后多糖；
(4)脱色:将XD-5大孔树脂用蒸馏水浸泡除去水溶性杂质剂及悬浮物，先用95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水水洗至无醇味且水液澄清，再用3倍树脂体积的3%稀盐酸溶液12h，用蒸馏水洗至中性，再用3倍树脂体积的3%强氧化钠溶液浸泡12h，用蒸馏水洗至中性后凉干，将脱蛋白后的多糖配置成2mg/ml的多糖溶液后，将XD-5大孔树脂和多糖溶液按lg:1OOml的比例加入恒温振荡器中，在温度为25°C，恒温振荡器频率为120次/min的条件下振荡吸附6h，过滤即得脱色多糖；
(5)透析:将步骤(4)所得多糖配置成10mg/ml溶液，用自来水流动透析48h，再用蒸馏水透析24h，然后用4倍体积的95 %乙醇醇沉，静置24h后抽滤，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗，50 °C真空干燥即得款冬花多糖。
[0017]实施例2
[0018]款冬花的提取与纯化方法，包括以下步骤:(I)粉碎、脱脂预处理:将款冬花花蕾在80 0C的烘箱中烘12h后，将其粉碎，过10目筛，按Ig:1Oml的料液比添加95 %乙醇溶液，回流脱脂2次，每次时间为2h，将提取液过滤，将滤饼中的乙醇挥干；
(2)预浸泡-超声-水提联合提取款冬花多糖:将预处理过的