一种固相萃取葛根中黄酮类化合物的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种固相萃取葛根中黄酮类化合物的方法，属于黄酮类化合物领域。
【背景技术】
[0002]黄酮类化合物是一类多酚类抗氧化剂，是葛根、补骨脂、黄芩、银杏、沙棘、槐米等临床常用中药材的主要活性成分。该类化合物不仅数量众多，而且结构复杂，具有许多重要的生理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗糖尿病并发症等，特别是异黄酮类化合物作为天然雌激素。
[0003]天然黄酮类化合物虽然生理活性丰富并且广泛存在于自然界，但因其溶解性差、生物利用度不高等缺点而限制了它们的临床应用。因此对自然界含量较高的天然黄酮进行半合成的结构修饰，使之达到成药要求，是合理开发利用该类化合物的一条重要途径，并且该方法具有原料来源丰富、化学合成步骤少、生产成本相对较低等优势。
[0004]固相萃取技术是近年来兴起的一项样品前处理技术，由于固相萃取中的固定相种类非常丰富，而流动相可以在各种不同的有机溶剂中选择，通过选择不同的固定相，与不同的流动相进行多种搭配组合，从而实现对目标组分与杂质之间的高选择性，再通过一定的优化试验，可以得到净化效果好、回收率高、重现性好的条件。
【发明内容】
[0005]本发明主要解决的技术问题:针对黄酮类化合物结构复杂，具有许多重要的生理活性，传统分离萃取材料选择性较差，经常需要多次溶剂萃取和柱层析来得到纯度高的活性成分，分离效率和收率较低，而且会造成环境污染的问题，提供了一种固相萃取葛根中黄酮类化合物的方法，本发明以黄岑素或黄岑苷为黄酮类模板，以甲基丙烯酸为功能单体，以N，N’_亚甲基双丙烯酰胺为交联剂制备出分子印迹固相萃取剂，利用分子印迹固相萃取剂在葛根粉酶解液中吸附，再淋洗回收葛根黄酮化合物，对其浓缩、干燥、粉碎即可，本发明得到的葛根黄酮类提取物纯度高，分离回收率高，提取过程中不需要大量溶剂，对环境友好，而且有效成分损失少、成本低、效率快、副产物少。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)精确称取I?2mmoI黄岑素或黄岑苷和5?1mmo I甲基丙稀酸装入I OOmL带有搅拌器、温度计和通气口的三口烧瓶中，再加入50?60mL无水乙醇，启动搅拌器搅拌直至反应物完全溶解，常温下密封静置使黄酮类模板和功能单体反应过夜；
(2)反应结束后在搅拌状态下继续加入4?5gN，N’_亚甲基双丙烯酰胺交联剂和20?25mg偶氮二异庚腈引发剂，经通气口向烧瓶中通入氮气置换出瓶中空气后密闭瓶口，将烧瓶移入水浴锅加热升温至45?60°C，保温反应20?24h产生淡黄色沉淀，过滤后干燥得分子印迹聚合物；
(3)将上述得到分子印迹聚合物研磨后过100目标准筛，将过筛后的粉末放入其体积3?5倍由0.511101/1甲醇和0.311101/1醋酸按体积比为10:1组成的混合液中沉降至上层液澄清为止，过滤后干燥即得分子印迹固相萃取剂，备用；
(4)称取I?2kg葛根放入药材粉碎机中粉碎并过100目标准筛，将500?600g过筛后的葛根粉装入搪瓷酶解罐中，再加入I?2L蒸馏水，用搅拌棒搅拌均匀后，按反应底物总质量6?8%加入复合酶制剂后，用浓度为0.5mol/L盐酸调节pH至4?5，放入恒温箱，在40?45 °C下酶解6?8h;
(5)酶解结束后，过滤去除滤渣得到酶解液，量取400?500mL酶解液装入IL烧杯中，按液固比为3:1向酶解液中加入备用的分子印迹固相萃取剂，再将烧杯放置超声振荡仪中，在频率为25?35kHz和功率为100?200W的条件下超声固相萃取50?60min;
(6)萃取结束后过滤分离得到固相萃取剂，将其装入直径为3cm，高为20cm的圆柱形玻璃柱中，用I?2L无水乙醇分3?5次对玻璃柱中的固相萃取剂进行淋洗并从玻璃柱下方收集淋洗液，将淋洗液合并后装入蒸馏装置中，蒸馏回收无水乙醇后得到葛根黄酮化合物浓缩液，最后经真空冻干后粉碎并过200目标准筛，包装，S卩得葛根黄酮类提取物。
[0007]所述的复合酶制剂是由纤维素酶和果胶酶按质量比为2:1复配制得。
[0008]本发明的应用的方法:本发明制得的葛根黄酮类提取物的提取率达到3.15?6.48%，纯度为53.6?62.8%，分离速度快，有效成分损失少、成本低，可广泛应用在化妆品、医药、食品等工业中，目前黄酮类化合物在食品工业中，可以作为天然甜味剂、天然色素、保健食品等;应用在药物中可具有抗炎镇痛、免疫调节、抗心脑血管疾病、抗癌抗肿瘤等作用。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明得到的葛根黄酮类提取物纯度高，分离回收率高，提取过程中不需要大量溶剂，对环境友好；
(2)本发明提取过程中有效成分损失少、成本低、效率快。
【具体实施方式】
[0010]首先精确称取I?2mmo I黄岑素或黄岑苷和5?I Ommo I甲基丙稀酸装入10mL带有搅拌器、温度计和通气口的三口烧瓶中，再加入50?60mL无水乙醇，启动搅拌器搅拌直至反应物完全溶解，常温下密封静置使黄酮类模板和功能单体反应过夜;反应结束后在搅拌状态下继续加入4?5gN，N’_亚甲基双丙烯酰胺交联剂和20?25mg偶氮二异庚腈引发剂，经通气口向烧瓶中通入氮气置换出瓶中空气后密闭瓶口，将烧瓶移入水浴锅加热升温至45?60°C，保温反应20?24h产生淡黄色沉淀，过滤后干燥得分子印迹聚合物;将得到分子印迹聚合物研磨后过100目标准筛，将过筛后的粉末放入其体积3?5倍由0.5mol/L甲醇和0.3mol/L醋酸按体积比为10:1组成的混合液中沉降至上层液澄清为止，过滤后干燥即得分子印迹固相萃取剂，备用;称取I?2kg葛根放入药材粉碎机中粉碎并过100目标准筛，将500?600g过筛后的葛根粉装入搪瓷酶解罐中，再加入I?2L蒸馏水，用搅拌棒搅拌均匀后，按反应底物总质量6?8%加入复合酶制剂后，用浓度为0.5mol/L盐酸调节pH至4?5，放入恒温箱，在40?45 °C下酶解6?8h;酶解结束后，过滤去除滤渣得到酶解液，量取400?500mL酶解液装入IL烧杯中，按液固比为3:1向酶解液中加入备用的分子印迹固相萃取剂，再将烧杯放置超声振荡仪中，在频率为25?35kHz和功率为100?200W的条件下超声固相萃取50?60min;萃取结束后过滤分离得到固相萃取剂，将其装入直径为3cm，高为20cm的圆柱形玻璃柱中，用I?2L无水乙醇分3?5次对玻璃柱中的固相萃取剂进行淋洗并从玻璃柱下方收集淋洗液，将淋洗液合并后装入蒸馏装置中，蒸馏回收无水乙醇后得到葛根黄酮化合物浓缩液，最后经真空冻干后粉碎并过200目标准筛，包装，即得葛根黄酮类提取物。
[0011]所述的复合酶制剂是由纤维素酶和果胶酶按质量比为2:1复配制得。
[0012]实例I
首先精确称取Immol黄岑素或黄岑苷和5mmo I甲基丙稀酸装入10mL带有搅拌器、温度计和通气口的三口烧瓶中，再加入50mL无水乙醇，启动搅拌器搅拌直至反应物完全溶解，常温下密封静置使黄酮类模板和功能单体反应过夜;反应结束后在搅拌状态下继续加入4gN，N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂和20mg偶氮二异庚腈引发剂，经通气口向烧瓶中通入氮气置换出瓶中空气后密闭瓶口，将烧瓶移入水浴锅加热升温至45°C，保温反应20h产生淡黄色沉淀，过滤后干燥得分子印迹聚合物;将得到分子印迹聚合物研磨后过100目标准筛，将过筛后的粉末放入其体积3倍由0.5mol/L甲醇和0.3mol/L醋酸按体积比为10:1组成的混合液中沉降至上层液澄清为止，过滤后干燥即得分子印迹固相萃取剂，备用；称取Ikg葛根放入药材粉碎机中粉碎并过100目标准筛，将500g过筛后的葛根粉装入搪瓷酶解罐中，再加入IL蒸馏水，用搅拌棒搅拌均匀后，按反应底物总质量6%加入复合酶制剂后，用浓度为0.5mol/L盐酸调节PH至4，放入恒温箱，在40°C下酶解6h;酶解结束后，过滤去除滤渣得到酶解液，量取400mL酶解液装入IL烧杯中，按液固比为3:1向酶解液中加入备用的分子印迹固相萃取剂，再将烧杯放置超声振荡仪中，在频率为25kHz和功率为100W的条件下超声固相萃取50min;萃取结束后过滤分离得到固相萃取剂，将其装入直径为3cm，高为20c