蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法
【专利摘要】一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的C1结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体K328R/D330N融合而得的。
【专利说明】
蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法。
【背景技术】
[0002] 生物试样中存在各种蛋白质，作为用于对特定蛋白质进行检测、定量的方法，已知 有ELISA(Enzyme_Linked TmmunoSorbent Assay，酶联免疫分析)等。
[0003] ELISA是使用酶标记抗体利用抗原抗体反应定量地检测试样中所含的抗原等特定 蛋白质的方法，是免疫检查等中通用的方法之一。ELISA中，已知的是直接吸附法、三明治 法N克争法等。
[0004] 例如，使针对吸附于固相表面的目标物质(抗原）的一抗通过抗原抗体反应进行结 合。洗去未反应的一抗后，添加带有酶标记的标记二抗，再次通过抗原抗体反应进行结合。 在其中洗去未反应的标记二抗、添加显色底物时，与抗原的量成比例地引起显色反应。通过 吸光光度计等对所生成的显色物质的吸光度进行测定，由使用已知浓度的标准品制作的标 准曲线能够对抗原的量进行定量。
[0005] 但是，这样的方法中，对于与目标物质(抗原)特异性结合的一抗，需要与其特异性 结合的标记二抗，在检测多种目标物质(抗原）时，需要准备分别与多种一抗特异性结合的 标记二抗，通用性差。
[0006] 一直以来，作为蛋白质检测用的酶，已知有碱性磷酸酶，其中，广泛使用的是CIAP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase，小牛肠碱性磷酸酶）XIAP是由牛的小肠纯化而 得的，一直被广泛地使用，近年来，通过基因重组而制作的CIAP也有售。但是，前者生产成本 高，难以保持稳定的品质。此外，后者的情况下，为了降低生产成本而用酵母等表达进行生 产，但是大多情况下发生糖链的过度附加、背景、粘性等问题。此外，CIAP虽然活性高，但稳 定性、特别是热稳定性差，难以长期维持活性，无法用于需要加热的基因相关应用。进而，稀 释时其活性也会降低，因此在长时间、以低浓度使用的实际应用中，无法充分发挥其高活性 特性。
[0007] BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase，细菌喊性磷酸酶)虽然稳定性高，但其活 性与CIAP相比仅为数十分之一左右，活性低，因此几乎不被用于蛋白质检测中。
[0008] 另一方面，存在如下方法:使用通过化学反应使碱性磷酸酶等酶和G蛋白结合而得 的酶标记G蛋白，来代替标记二抗。G蛋白是来自链球菌的细胞壁的蛋白质，具有与几乎所有 哺乳动物的IgG发生结合的性质。若使用这样的酶标记G蛋白，则能够与多种免疫种（免疫 種)的一抗结合，即使在对多种目标物质(抗原)进行检测的情况下，也可以不准备与各物质 分别特异性结合的抗体，通用性高。
[0009] 但是，使用用碱性磷酸酶等酶标记的酶标记G蛋白的方法存在检测灵敏度低的问 题。此外，也存在热稳定性差的种类，有时会在处理中失活。
[0010] 非专利文献1记载了 ：制作使G蛋白（SpG)的Cl结构域结合于海萤荧光素酶的N末端 的融合蛋白，但没有抗体结合能力，与在两者间插入了连接子力一)GGGGS的蛋白结果 相同。
[0011] 非专利文献2记载了 G蛋白的基因序列、氨基酸序列、结构、各结构域的功能等。
[0012] 非专利文献3记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的双重突变体、例 如D153G/D330N、D153H/D330N等，对活性、稳定性、最适pH、底物、金属离子的亲和性和活性 进行了考察。
[0013] 专利文献1中记载了对BAP的特定位置的氨基酸残基进行了置换的突变体D153G、 K328R及双重突变体V99A/K328R，记载了用于三明治ELISA、竞争法等用途。
[0014]专利文献2中记载了MP的第329位、第330位、第153位/第328位的突变体，并记载 了进行与抗原的融合蛋白的制作和竞争ELISA。
[0015] 专利文献3中记载了K328R等BAP突变体，记载了与抗体进行化学结合进行ELISA。
[0016] 现有技术文献 [0017]专利文献
[0018] 专利文献1:日本专利第3560972号公报 [0019] 专利文献2:日本特开平9-098780号公报 [0020] 专利文献3:日本专利第2620416号公报 [0021]非专利文献
[0022] 非专利文南犬I:Engineering of functional chimeric protein G-Vargula luciferase,ANALYTICAL BIOCHEMISTRY,249(2),pp.147-152(1997)
[0023] 非专利文南犬 2 : Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G1Biochem J.,267(1),pp.171-177(1990)
[0024] 非专利文南犬3: Improving Escherichia coli Alkaline Phosphatase Efficacy by Additional Mutations inside and outside the Catalytic Pocket., Chembiochem.,2,pp.517-523,(2001)
【发明内容】
[0025] 发明要解决的课题
[0026] 本发明在于，提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质检测用融合 蛋白及使用其的蛋白质检测方法。
[0027]用于解决课题的手段
[0028] 本发明为一种蛋白质检测用融合蛋白，其为使包含G蛋白的Cl结构域、G蛋白的C2 结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP) 的第153位的氨基酸残基Asp置换成Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突 变体D153G/D330N、将大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸残基Asp置换成His且 将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体D153H/D330N、或将大肠杆菌碱性磷酸 酶(BAP)的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的 双重突变体K328R/D330N融合而成的。
[0029] 此外，前述蛋白质检测用融合蛋白中，前述蛋白质结构域优选A蛋白的B结构域、G 蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域结合而成的结构域。
[0030] 此外，本发明为一种蛋白质检测方法，使前述蛋白质检测用融合蛋白和对象物中 存在的蛋白质直接或间接结合，对所结合的前述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分 作为标记部分进行检测。
[0031] 发明效果
[0032] 本发明中，通过使包含G蛋白的Cl结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中 的至少一个的蛋白质结构域与大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP)的双重突变体D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N融合，从而能够提供一种通用性高、检测灵敏度高、且稳定性 高的蛋白质检测用融合蛋白及使用其的蛋白质检测方法。
【附图说明】
[0033] 图1为表示本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的一例的结构的示意图。
[0034]图2为表示实施例1中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端）的表达量的图 (2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153G/D330N的泳 动位置）。
[0035] 图3为表示实施例1中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点:N末端）的表达量的图（TMN 培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153G/D330N的泳动位 置)。
[0036] 图4为表示实施例1中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端）的表达量的图 (2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153H/D330N的泳 动位置）。
[0037] 图5为表示实施例1中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点:N末端）的表达量的图（TMN 培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-D153H/D330N的泳动位 置)。
[0038] 图6为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端）的表达量的图 (2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳 动位置）。
[0039] 图7为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点:N末端）的表达量的图（TMN 培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位 置)。
[0040]图8为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端）的表达量的图 (2SLN培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳 动位置）。
[0041 ] 图9为表示实施例1中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端）的表达量的图（TMN 培养基、以培养上清为3mL的规模进行培养、3个重复、箭头表示pG-K328R/D330N的泳动位 置)。
[0042] 图10为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-D153G/D330N)的纯 化的图（载体:PBIC4、pBIC7、pBIC8、培养基:2SLN、箭头表示pG-Dl53G/D330N的泳动位置）。 [0043] 图11为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-D153G/D330N)的纯 化的图（载体:PBIC4、pBIC7、pBIC8、培养基:TMN、箭头表示pG-Dl53G/D330N的泳动位置）。 [0044] 图12为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-D153H/D330N)的纯 化的图（载体:PBIC7、pBIC8、培养基:2SLN、箭头表示pG-Dl53H/D330N的泳动位置）。
[0045] 图13为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-D153H/D330N)的纯 化的图（载体:PBIC7、pBIC8、培养基:TMN、箭头表示pG-Dl53H/D330N的泳动位置）。
[0046] 图14为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-K328R/D330N(pG结 合位点:N末端））的纯化的图（载体:pBIC4、pBIC8、培养基:2SLN、箭头表示pG-K328R/D330N 的泳动位置）。
[0047] 图15为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-K328R/D330N(pG结 合位点:N末端））的纯化的图（载体:pBIC4、pBIC8、培养基:TMN、箭头表示pG-K328R/D330N的 泳动位置）。
[0048] 图16为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-K328R/D330N(pG结 合位点：C末端））的纯化的图（载体:pBIC2、pBIC3、pBICl、培养基:2SLN、箭头表示pG-K328R/ D330N的泳动位置）。
[0049] 图17为表示实施例2中的、利用Ni-NTA柱进行的表达蛋白（pG-K328R/D330N(pG结 合位点：C末端））的纯化的图（载体:pBICl、pBIC3、培养基:TMN、箭头表示pG-K328R/D330N的 泳动位置）。
[0050] 图18为表示实施例3中的、PG-D153G/D330N及PG-D153H/D330N纯化标准品（Fr. 1) 的ALP活性的图（45°C下测定、图中数值为9个重复测定的平均值土标准偏差）。
[0051 ] 图19为表示实施例3中的、PG-K328R/D330N纯化标准品（Fr. 1)的ALP活性的图（45 °C下测定、图中数值为9个重复测定的平均值土标准偏差）。
[0052]图20为表示实施例3中的、pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端）的蛋白印迹结果 的图。
[0053]图21为表示实施例3中的、pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端）的蛋白印迹结果 的图。
[0054]图22为表示实施例3中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端）的蛋白印迹结果 的图。
[0055]图23为表示实施例3中的、pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端）的蛋白印迹结果 的图。
[0056] 图24为表示pG-BAP突变体(D153G/D330N)的氨基酸序列的图。
[0057] 图25为表示pG-BAP突变体(D153H/D330N)的氨基酸序列的图。
[0058]图26为表示pG-BAP突变体(K328R/D330N(pG结合位点：N末端））的氨基酸序列的 图。
[0059]图27为表示pG-BAP突变体(K328R/D330N(pG结合位点：C末端））的氨基酸序列的 图。
[0060] 图28为表示PBIC载体图谱的图（在分泌信号的下游直接插入了目标基因。启动子： 来自于桥石短芽孢杆菌(B. choshinensis)的P22、P2蛋白质基因的5 '序列、Rep:质粒自我复 制相关蛋白、Ori :质粒复制起点、Nmr:新霉素耐性基因）。
【具体实施方式】
[0061] 以下说明本发明的实施方式。本实施方式是用于实施本发明的一个例子，本发明 不受本实施方式限定。
[0062] 本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白是使包含G蛋白的Cl结构域、G蛋白的C2结构 域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的双重 突变体 D153G/D330N、D153H/D330N、或 K328R/D330N 融合而成的。
[0063] 作为与检测对象蛋白直接或间接结合的蛋白质结构域，本发明人等着眼于G蛋白。 G蛋白是来自于链球菌的细胞壁的蛋白，具有与几乎所有哺乳动物的IgG发生结合的性质。 研究将该G蛋白用碱性磷酸酶标记后能否作为标记二抗等的替代物来利用。
[0064] 此外，作为与检测灵敏度及稳定性有关的酶标记、即碱性磷酸酶，本发明人等着眼 于大肠杆菌碱性磷酸酶(BAP)的第153位或第328位的氨基酸残基与活性有关、第330位的氨 基酸残基与稳定性有关这一点，选出大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP)的双重突变体D153G/ D330N、D153H/D330N、及 K328R/D330NC3BAP 的双重突变体 D153G/D330N 及 D153H/D330N 与此前 常用的CIAP相比稳定性高、与BAP(Wild type，野生型)相比活性高。
[0065] 这里，BAP的双重突变体D153G/D330N是将MP的第153位的氨基酸残基Asp置换成 Gly且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的突变体，D153H/D330N是将BAP的第153位的 氨基酸残基Asp置换成His且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的突变体，K328R/D330N 是将BAP的第328位的氨基酸残基Lys置换成Arg且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的 突变体。
[0066] 本发明人等进行了深入研究，发现通过使包含G蛋白的Cl结构域、G蛋白的C2结构 域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与MP的双重突变体D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N融合，可获得通用性高、检测灵敏度高、且稳定性高的蛋白质 检测用融合蛋白。
[0067] 作为蛋白质结构域，只要包含作为G蛋白的IgG结合结构域的Cl结构域、C2结构域 及C3结构域中的至少一个即可，没有特别限制，从不易从抗体脱离等观点出发，优选包含G 蛋白的C2结构域和G蛋白的C3结构域进行连结的结构域。此外，从G蛋白对抗体等的反应性 提高等观点出发，优选包含A蛋白的E结构域、A蛋白的D结构域、A蛋白的A结构域、A蛋白的B 结构域、A蛋白的C结构域中的至少一个，更优选包含A蛋白的B结构域。特别优选A蛋白的B结 构域、G蛋白的C2结构域和G蛋白的C3结构域结合而成的结构域。
[0068] 既可以是使G蛋白的C2结构域与融合型碱性磷酸酶的C末端侧融合而成的产物，也 可以是使其与N末端侧融合而成的产物。从表达稳定性等观点出发，优选使G蛋白的C2结构 域与融合型碱性磷酸酶的N末端侧融合而成的产物。
[0069]本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白可以具有His标签等标签，所述His标签是标 签肽的一种，由6个左右的连续的组氨酸(Hi s)残基构成。
[0070] 图1示意性示出本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的一个例子的结构。本实施 方式的蛋白质检测用融合蛋白例如是：在MP的双重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或 K328R/D330N的N末端侧结合有A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域、且 在BAP的双重突变体的C末端侧附加有His标签的蛋白；在MP的双重突变体D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N的C末端侧结合有A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白 的C3结构域、且在G蛋白结构域的C末端侧附加有His标签的蛋白。
[0071] 本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白可以通过基因工程手法、以使包含G蛋白的 Cl结构域、G蛋白的C2结构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个的蛋白质结构域与BAP的双 重突变体D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合而成的融合蛋白形式来表达而获 得。此外，此时还可以对G蛋白结构域或BAP的双重突变体的N末端侧或C末端侧赋予His标签 等标签。
[0072]融合蛋白的纯化可以利用附加于N末端或C末端的纯化用肽标签（例如，（His)6_ tag(六组氨酸标签)）通过凝胶过滤色谱、固定化金属离子亲和色谱等来进行。
[0073] 融合蛋白的氣基酸序列的确认可以通过对编码该蛋白的质粒载体的基因序列进 行DNA测序来进行确认。融合蛋白的纯化的确认可以用SDS-PAGE等来进行。
[0074] 根据本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白，能够对几乎所有动物种类的一抗进行 检测。本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白的检测灵敏度比现有的标记G蛋白高、稳定性也 高。此外，检测灵敏度与现有的标记二抗相同或更高，通用性高。若使用本实施方式的蛋白 质检测用融合蛋白，则能够与多种免疫种的（一次)抗体结合，可以不针对每个免疫种准备 二抗，通用性高。
[0075] 该蛋白质检测用融合蛋白是来自于细菌的蛋白质，不存在翻译后修饰的问题，可 以用微生物的表达体系进行制作。此外，若利用分泌表达体系，则能够高效率地进行生产。 与对来自动物的蛋白进行提取、纯化或用动物细胞对来自动物的蛋白进行表达、生产的情 况相比，能够更廉价地进行制造。
[0076]来自于动物的CIAP等含有糖链。据称，糖链是吸附于测定容器、膜等的原因之一， 有时会产生高背景。但是，BAP的双重突变体由于不存在作为高背景的原因的糖链修饰，因 此不易产生在来自于动物的酶中可见的由背景及高粘性导致的操作问题等。
[0077]酶部分与BAP相比活性高，与CIAP相比稳定性优异，在高温下也具有一定程度的耐 性，因此还可以用于必须进行温度处理的基因检测（杂交)等的灵敏度的提高中。此外，与现 有的pG-CIAP相比，能够以高灵敏度检测蛋白质。
[0078] <蛋白质检测方法>
[0079] 本实施方式的蛋白质检测方法是使前述蛋白质检测用融合蛋白与存在于对象物 中的蛋白质直接或间接结合、对所结合的蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标 记部分进行检测的方法。
[0080] 本实施方式的蛋白质检测用融合蛋白及蛋白质检测方法可以用于例如蛋白印迹、 ELI SA、免疫沉降、免疫组化(免疫染色)等基础研究领域、病理检查领域等。
[0081 ] 实施例
[0082] 以下列举实施例及比较例对本发明进行更具体、详细的说明，但本发明不受以下 实施例限定。需要说明的是，下述实施例中，室温是指20~25°C下feS。
[0083] [实施例1]
[0084] 在Brevibaci Ilus表达载体中插入pG-BAP突变体的基因片段，进行表达载体的构 建。完成了表达载体的构建后，实施转化及规定时间的培养，将培养上清和菌体分离后，确 认培养上清中所含的目标蛋白的生产量。
[0085] <材料及试验方法>
[0086] 1.表达载体(质粒）
[0087]使用了Brevibaci Ilus的分泌表达暗示各目标蛋白的最适的蛋白质合成速度及分 泌信号可能是不同的。因此，使用了将2种启动子(pBICl、pBIC2、pBIC3、pBIC4:P22启动子 (序列号9)、？8105、？8106、？8107、？8108:?2启动子(序列号10))及4种的分泌信号（？81(：1、 PBIC5:序列号 ll、pBIC2、pBIC6:序列号 12、pBIC3、pBIC7:序列号 13、pBIC4、pBIC8:序列号 14)组合的共计8种表达用载体(参照图28)。
[0088] 使用的载体:pBICl~pBIC8[HIGETA SYOYU有限公司提供]
[0089] 2.表达载体的构建
[0090]在 pG-BAP 突变体的基因片段（pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N 及 pG-K328R/ D330N)向表达用载体的插入中，利用了无需酶处理的简便质粒构建法、即BIC法 (Brevibacillus In vivo Cloning) AIC法中，将在编码目标蛋白的基因的两端附加有与 直链状表达载体的两末端相同的15bp的序列的DNA与载体混合，导入感受态细胞。在菌体内 发生同源重组反应，形成表达质粒。对8种载体中的能够构建载体、能够获得目标蛋白表达 用的载体的载体实施下述的表达试验。
[0091] 3.分泌表达用宿主
[0092] 桥石短芽抱杆菌（Brevibacillus choshinensis)HPD31_SP3株[HIGETA SYOYU有 限公司提供]
[0093] 4 .Brevibac i Ilus 的转化（DNA 导入）
[0094] 将短芽孢杆菌HPD31-SP3株用MT培养基（添加有20mM MgCl2的TM培养基（参照表 1))在37°C下振荡培养至对数增殖期，通过离心分离收集菌体。然后，悬浮在50mM Tris-HCl (ρΗ7·5)中，通过离心分离收集菌体后，再悬浮于50mM Tris-HCl(pH8.5)，37°C下振荡60分 钟。对所振荡的悬浊液500yL进行离心分离而收集菌体，加入2ngAiL的表达载体DNA溶液5yL 和0.5M NaS03/70mM磷酸缓冲液（pH6.3) 50yL的混合液，悬浊，静置5分钟后，添加40 % PEG6000/70mM磷酸缓冲液(pH6.3) 150yL，用涡旋混合器搅拌、悬浊。
[0095] [表1]
[0096] 表 1
[0098]~5.转化体的筛选
[0099]对进行了转化的菌体通过离心分离而收集菌体，悬浮于ImL的TM培养基，37 °C下振 荡60分钟。然后，涂抹于TMN(在TM培养基中添加有10yg/mL的新霉素的琼脂培养基），37°C培 养30小时，对转化体进行筛选。
[0100] 6.转化体的培养
[0101] 将3mL的TMN培养基、及2SLN培养基(在2SL培养基(参照表2)中添加50yg/mL的新霉 素)分装到直径16mm的试管，接种前项中筛选出的单一菌落。在30°C、120rpm的条件下进行 48小时的振荡培养。
[0102] [表 2]
[0103] 表2
[0105] 7.菌体和培养上清的分离
[0106] 进行离心分离(5000g、5分钟）将菌体和培养上清分离。使培养上清通过0.22μπι的 过滤灭菌用过滤器，将菌体去除。
[0107] 8.表达确认
[0108]在培养上清中添加等量的2X样品缓冲液，100°C下变性5分钟后，供于SDS-PAGE， 进行了各样品中的生产蛋白质的大小确认、及表达生产量的推定、比较。
[0109] 〈结果〉
[0110] 1.菌体内及培养上清中的表达确认
[0111] · pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端）
[0112] 对于pG-D153G/D330N，对2种载体及4种信号肽的共8种组合中能够获得表达质粒 的4种实施了表达试验。在2SLN培养基(培养上清）的情况下，pBIC4、pBIC7及pBIC8可确认到 高水平的表达量，各个重复间也几乎没有差异，显示其在进行稳定的表达。获知:在TMN培养 基中，除了表达量比2SLN培养基多以外也为同样的倾向，对于pBIC6而言，两种培养基中都 几乎不生产目标蛋白（图2、3) 4G-D153G/D330N的氨基酸序列如图24及序列号1所示，DNA序 列如序列号2所示。
[0113] · pG-D153H/D330N(pG结合位点：N末端）
[0114] 获得了 5种表达载体的pG-D153H/D330N的情况下，在2SLN及TMN两培养基中可见高 表达的是PBIC7及pBIC8,具有在TMN培养基中表达量多的倾向。也未确认到各个重复间的偏 差，因此暗示了显示稳定的表达的可能性。在pBICl、pBIC5及pBIC6中，几乎未确认到pG-D153H/D330N的表达（图4、5) 46-015311/033(^的氨基酸序列示于图25及序列号3，DNA序列 示于序列号4。
[0115] 需要说明的是，pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N两者的表达量都多，由SDS-PAGE 的条带强度可以期待g/L水平的生产量。
[0116] · pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端）
[0117] pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端）的情况下，获得的4种表达载体中生产目标 蛋白的是PBIC4及pBIC8。任一者在各个重复间的偏差小、显示出稳定的表达，从培养基种类 来看，可确认到PBIC8在TMN培养基中表达量相对地多的倾向（图6、7) 结合位点:N末端)的氨基酸序列如图26及序列号5所示，DNA序列如序列号6所示。
[0118] · pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端）
[0119] C末端结合有pG的K328R/D330N的情况下，所获得的3种表达载体(pBICl、pBIC2、 PBIC3)的结果是:在2SLN培养基中各载体均确认到目标蛋白的生产，在TMN培养基中，pBIC2 的生产量显著少。我们认为:将N末端结合有pG的情况与C末端结合有pG的情况相比，确认到 生产的表达载体在目标蛋白条带强度方面没有较大差异。但是，结合在C末端的表达载体在 3个重复的试验中不能同等地生产，暗示与结合在N末端的表达载体相比蛋白质表达可能缺 乏稳定性（图8、9)。?6-1(3281?/1)33(^(?6结合位点:C末端）的氨基酸序列如图27及序列号7所 示，DNA序列如序列号8所示。
[0120] [实施例2]
[0121 ] 在用Brevi bacillus表达的BAP突变体中，如上所述组氨酸标签(H6tag)附加在C 末端，可以用Ni-NTA柱比较简便地进行纯化。本实施例中，从培养上清获得纯化标准品。 [0122] <材料及试验方法>
[0123] 1.目标蛋白的纯化
[0124] 使用作为Ni-NTA柱的一种的His SpinTrap Kit(28-9321-71/GE Healthcare)进 行简单纯化。纯化操作按照所附的处理说明书进行，使用300~600yL的培养上清，将柱结合 时的培养上清的咪唑浓度、以及结合(洗涤)缓冲液的咪唑浓度设为40mM、洗脱缓冲液的咪 唑浓度设为500mM。此外，将培养上清加到柱中后，进行3次洗涤，实施2次酶洗脱，将洗脱级 分分别设为级分l、2(Fr. l、Fr.2)。
[0125] 2.脱盐及浓缩
[0126] 纯化的突变体酶液含有高浓度的咪唑，进行了预讨论，结果确认对酶活性有不良 影响，因此为除去咪唑而实施脱盐、进行溶剂交换而交换为保存缓冲液(下述）。该操作中， 使用了凝胶过滤法（Zeba Desalt Spin Columns、89890/Thermo Scientific)、或超滤法 (Amicon Ultra Centrifugal Filters、IOK membrane、UFC501024/Millipore)。溶剂交换 后的纯化标准品通过超滤（同上)而浓缩4~5倍左右，4°C下保存。
[0127] 保存缓冲液：IOOmM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、lmM MgCh、20yM ZnCl2
[0128] 3.纯度确认及蛋白质定量
[0129] 获得的纯化标准品通过SDS-PAGE法确认了纯度。凝胶使用了 Min i -PROTEAN (注册 商标）TGX(商标）预制胶（456-1036/Bio-Rad)。电泳后的凝胶通过用纯水洗涤、CBB染色 (Quick-CBB PLUS、178-00551/和光纯药)而使蛋白质条带可视化。
[0130] 蛋白质定量通过Micro BCA法（BCA Protein Assay Reagent Kit、23227/Thermo Sc i ent i f i c)进行。将规定量的纯化标准品和检测试剂等量混合后，在60 °C下处理I小时，冷 却，然后测定0D562。使用BSA(Bovine Serum Albumin)作为标准蛋白质制作标准曲线，求出 蛋白质含量。
[0131] < 结果 >
[0132] 1.利用Ni-NTA柱进行的纯化
[0133] · pG-D153G/D330N(pG结合位点：N末端）
[0134] 对于表达试验中表达量多的pG-D153G/D330N中的载体及培养基的组合，由培养上 清使用Ni-NTA柱进行了简单纯化（图10、11)。供试的任一组合(？8扣4、？8扣7、？8108)的纯化 级分中，杂蛋白均被几乎完全除去，能够获得高纯度的纯化标准品。
[0135] · pG-D153H/D330N
[0136] 在pG-D153H/D330N的情况下，在2SLN培养基及TMN培养基两者中，pBIC7及pBIC8的 组合也能够纯化出高纯度的标准品。此外，纯化标准品的分子量也与pG-Dl 53G/D330N为同 样的结果(图12、13)。
[0137] · pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端）
[0138] 使用2SLN培养基时，pBIC4能够利用Ni-NTA柱进行纯化，能够获得高纯度的纯化标 准品。但是，PBIC8的柱未结合级分中仅存在少量蛋白质，在此后的柱洗涤中也同样。即使使 用具有高浓度咪唑的洗脱缓冲液也几乎无法获得，暗示蛋白质牢固吸附于Ni-NTA柱，可能 无法回收（图14) ^MN培养基的情况下，pBIC4、pBIC8两者都能够纯化出目标蛋白（图15)。仅 仅在使用2SLN培养基的情况下pBIC8吸附于柱的原因目前尚未阐明。
[0139] · pG-K328R/D330N(pG结合位点：C末端）
[0140] 对于pG-K328R/D330N(pG结合位置:C末端）也同样地对确认了蛋白质表达量的情 况实施了简单纯化（图16、17) 2SLN培养基的情况下，pBICl、pBIC2及pBIC3能够获得纯化标 准品，此外，TMN培养基的情况下，pBICl、pBIC3能够获得纯化标准品。
[0141] [实施例3]
[0142] 对纯化获得的各标准品的酶部分、及抗体结合蛋白部分实际是否能发挥功能进行 了确认，为了研究能否用作蛋白质检测试剂，以市售的试剂作为对照，实施了碱性磷酸酶 (ALP)活性测定和蛋白印迹中的检测灵敏度的比较。
[0143] <材料及试验方法>
[0144] I. ALP活性测定
[0145] 将酶标准品用酶稀释缓冲液稀释为规定浓度，在96孔微孔板的各孔中添加5yL。然 后，添加底物(P-NPP:对硝基苯磷酸盐、149-02342/和光纯药)溶液95yL，使用酶标仪（SH-9000Lab/3 口于电气）对底物的去磷酸化所引起的吸光度变化(0D410)每隔20~30sec测 定，测定18次。测定温度设为45 °C。酶的比活性(μπιοI p-NP/mg protein/sec)利用已知浓度 的酶产物(P-NP:对硝基苯酚、299-58641/和光纯药）的标准曲线而求出。需要说明的是，酶 的稀释及底物、酶产物的溶解、稀释中使用了下述缓冲液，底物溶液的P-NPP浓度设为ImM。 作为比较对照，使用了用酵母表达的来自牛小肠的ALP即CIAP(AP highly active rec.EIA S，CR，03 535 452/Roche)、&PLAP(PlacentalAlkalinePhosphatase、P3895/Sigma)〇
[0146] 酶稀释缓冲液：IOOmM DEA-HCl(ρΗ9· 5)、ImM MgCl2
[0147] 底物、酶产物稀释、溶解缓冲液：1M DEA-HCl(pH9.5)、lmM MgCl2
[0148] 2.基于蛋白印迹的检测灵敏度研究
[0149] 抗原使用了作为血清蛋白的来自于人的转铁蛋白（Calbiochem/616419)。用2X样 品缓冲液制作了 I Ong~3pg/15yL的稀释系列，每个泳道上样15yL，进行SDS-PAGE。制作了转 印有相同稀释系列的转铁蛋白的Hybond P(PVDF)膜，进行抗原抗体反应后，对检测灵敏度 进行了比较。详细步骤以及比较对照中使用的试剂如以下所示。
[0150] 样品缓冲液（2X ) :62.5mM 1^8-出：1(口!16.8)、2%505、25%甘油、0.01%8?8 (Bromophenol blue、029-02912/Wako)、10%疏基乙醇（M3148/Sigma)
[0151] SDS-PAGE (200V 恒定电压条件、30min)
[0152] 凝胶:Mini-PROTEAN TGX凝胶 10% (Bio-Rad/456-1035)
[0153] 泳动缓冲液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、0.1%SDS
[0154] 丄
[0155] 印迹(200mA恒定电流条件、40min)
[0156] 膜:Hybond P膜(GE医疗/RPN2020F)
[0157] 转印缓冲液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、20% 甲醇
[0158] 丄
[0159] 膜洗涤 〇83、311^11\2次）
[0160] TBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2.68mM KC1)
[0161] 丄
[0162] 封闭（5%Skim Milk Powder(198-10605/Wako)/TBST、室温、搅拌、60min)
[0163] TBST(0.1%Tween20/TBS)
[0164] 丄
[0165] 膜洗涤 〇831\511^11\3次）
[0166] 丄
[0167] -抗反应(室温、搅拌、60min)
[0168] 抗体:兔抗人转铁蛋白抗体(DAK0/A0061 )1/2,000稀释(4.3yg/mL TBST)
[0169] 丄
[0170] 膜洗涤（TBST、5minXM*)
[0171] 丄
[0172] pG-碱性磷酸酶反应(室温、搅拌、60min)
[0173] pG-ΒΑΡ突变体纯化标准品使用Fr. 1
[0174] 处理浓度：0.5yg/mL TBST
[0175] I
[0176] 膜洗涤(TBST、5minXM*)
[0177] I
[0178] 发光检测
[0179] 每隔150秒获得图像，直至7，200秒为止。
[0180] 测定器:ChemiDoc XRS+(170-8265JlPC/Bi〇-Rad)
[0181] 发光底物：CDP-Star Ready-t〇-use(Roche/l2〇4l677〇01)
[0182] 比较对照试剂
[0183] pG_CIAP(Protein G Alkaline Phosphatase Conjugated、PGO〇-〇5/Rockland)
[0184] < 结果 >
[0185] I .ALP活性
[0186] 图18示出pG-D153G/D330N及pG-D153H/D330N(pG结合位置均为N末端）的ALP活性 测定结果。测定值的偏差稍大，但PG-D153G/D330N的比活性为350~450ymol p-NP/mg prot./min，存在TMN培养基情况下比活性较高的倾向。
[0187] 另一方面，pG_D153H/D330N的比活性为50μηιο1 p-NP/mg prot./min左右，与pG-D153G/D330N相比，该值是显著低的。
[0188] 图19示出pG-K328R/D330N(pG结合位点：N末端及C末端）的活性测定结果。虽然确 认到N末端结合时活性值的大小，但N末端、C末端的情况下其比活性均为2 0 0μπι〇 I /mg protein/min左右，我们认为两者间没有大差异。
[0189] 由以上结果可知，所制作的pG-ΒΑΡ突变体的ALP活性从高到低分别为：
[0190] pG-D153G/D330N>pG-K328R/D330N>pG-D153H/D330N
[0191 ] 2.基于蛋白印迹的检测灵敏度
[0192] 使用纯化标准品（Fr. 1)进行蛋白印迹并进行了发光检测，结果如图20~23所示。 PG-D153G/D330N除了pBIC8(2SLN培养基）以外均能够检测3~IOpg的转铁蛋白。作为对照的 pG-CIAP为IOOpg左右，因此暗示了 pG-D153G/D330N的检测灵敏度可能高10~30倍（图20)。 另一方面，PG-D153H/D330N的检测灵敏度为30~100pg，与市售的pG-CIAP没有大差异，可认 为其低酶活性被反映到检测灵敏度中（图21) 4G-K328R/D330N的情况下，比pG-D153G/ D330N稍差，但N末端结合有pG、C末端结合有pG的情况下检测灵敏度均为IOpg左右，暗示可 能比作为对照的pG-CIAP高10倍左右（图22、23)。
[0193] 基于以上结果可知，由Brevi bacillus分泌表达的目标蛋白保持了抗体结合活 性、ALP活性。此外获知，在蛋白印迹这一实际应用中，此次供试的pG-D153G/D330N及pG-K328R/D330N与市售的现有产品相比显示出高检测灵敏度，作为蛋白质检测试剂是有用的。
[0194] 在K328R/D330N的情况下，无论是N末端还是C末端结合，在ALP活性、蛋白印迹两者 中都几乎没有性能差异。
[0195] 在D153G/D330N、D153H/D330N的情况下，仅研究了pG的结合位点为N末端的情况， 但这些变异位点为磷酸、Mg 2+及Zn2+的结合位点附近，即使是pG的结合位点为C末端而使立 体结构改变，也不会妨碍PG的抗体结合活性，在性能方面获得同等结果的可能性高。
[0196] 在K328R/D330N的情况下，表达生产的稳定性方面是N末端的情况更为优异。我们 认为，原因之一是C末端结合有pG时载体难以在宿主内稳定地保持。
【主权项】
1. 一种蛋白质检测用融合蛋白，其特征在于，是使包含G蛋白的Cl结构域、G蛋白的C2结 构域及G蛋白的C3结构域中的至少一个蛋白质结构域与双重突变体D153G/D330N、双重突变 体D153H/D330N、或双重突变体K328R/D330N融合而成的， 所述双重突变体D153G/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基 Asp置换成Gly、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体， 所述双重突变体D153H/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸残基 Asp置换成His、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体， 所述双重突变体K328R/D330N为将大肠杆菌碱性磷酸酶BAP的第328位的氨基酸残基 Lys置换成Arg、且将第330位的氨基酸残基Asp置换成Asn的双重突变体。2. 根据权利要求1所述的蛋白质检测用融合蛋白，其特征在于， 所述蛋白质结构域是A蛋白的B结构域、G蛋白的C2结构域和G蛋白的C3结构域结合而成 的。3. -种蛋白质检测方法，其特征在于， 使权利要求1或2所述的蛋白质检测用融合蛋白与对象物中存在的蛋白质直接或间接 结合，对所结合的所述蛋白质检测用融合蛋白的碱性磷酸酶部分作为标记部分进行检测。
【文档编号】G01N33/68GK105829348SQ201480056879
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年10月6日
【发明人】神谷典穗, 松叶恭, 松叶恭一, 永井贤治, 林浩之辅
【申请人】国立大学法人九州大学, 株式会社日立制作所