抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用

抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用
【专利摘要】本发明公开了抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用。本发明提供的应用中，抗病相关蛋白是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的抗病相关蛋白及其编码基因可以调控植物的抗病性，提高抗病相关蛋白的表达可以提高植物的抗病性，降低抗病相关蛋白的表达可以降低植物的抗病性，可以利用抗病相关蛋白及其编码基因调控植物的抗病性。
【专利说明】
抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻不仅是世界上最为重要的粮食作物，约有全球半数以上人口以此为食，它还 是单子叶植物研究的模式植物。然而，在可耕地面积不断减少，人口数量不断膨胀的形势 下，水稻产量已成为影响我国粮食安全的重要因素之一。虽然经历了绿色革命和杂交技术 的广泛应用，但病虫害，恶劣的自然环境等因素依然严重地制约了水稻产量的增长。白叶枯 病是水稻生产中的所遇到的非常严重的病害，水稻感染上白叶枯病后，一般减产20-30%， 甚至绝收。鉴定和分离水稻抗白叶枯病基因，特别是生产中广泛应用的广谱抗病基因已成 为水稻分子育种的重要环节。

【发明内容】

[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应 用;所述抗病相关蛋白的名称为0sAPX8,是如下Al)、A2)或A3):
[0005] Al)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
[0006] A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗病相关的蛋白质；
[0007] A3)在Al)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0008] 为了使Al)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0009] 表1、标签的序列
[0011] 上述A2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0012] 上述A2)中OsAPXS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 [0013] 上述A2)中0sAPX8的编码基因可通过将序列1或序列4所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/ 或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0014] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与OsAPXS相关的生物材料在调控植物抗病 性中的应用;所述生物材料为下述Bl)至B16)中的任一种：
[0015] BI)编码0sAPX8的核酸分子；
[0016] B2)含有BI)所述核酸分子的表达盒；
[0017] B3)含有BI)所述核酸分子的重组载体；
[0018] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0019] B5)含有BI)所述核酸分子的重组微生物；
[0020] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0021 ] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0022] B8)含有M)所述重组载体的重组微生物；
[0023] B9)含有BI)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0024] B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0025] B11)含有BI)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0026] Bl 2)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0027] Bl 3)含有Bl)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0028] B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0029] B15)降低0sAPX8表达的核酸分子；
[0030] B16)含有B15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞 系。
[0031] 上述应用中，BI)所述核酸分子可为如下bl)_b5)中任一种：
[0032] bl)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
[0033] b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0034] b3)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；
[0035] b4)与bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码 0sAPX8的cDNA分子或基因组DNA分子；
[0036] b5)在严格条件下与bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码0sAPX8的cDNA 分子或基因组DNA分子；
[0037] Bl 5)所述核酸分子为与序列4所不的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。
[0038] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0039]其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的蛋白质。序列3来源于水稻，为OsAPXS 基因的基因组序列，序列4为0sAPX8基因的cDNA序列。
[0040] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码OsAPXS的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的OsAPXS的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码OsAPXS且具有 OsAPXS功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0041] 这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％)表示，其可以 用来评价相关序列之间的同一性。
[0042] 上述应用中，所述严格条件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0043] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0044] 上述应用中，B2)所述的含有编码0sAPX8的核酸分子的表达盒(0sAPX8基因表达 盒），是指能够在宿主细胞中表达0sAPX8的DNA，该DNA不但可包括启动0sAPX8基因转录的启 动子，还可包括终止OsAPXS基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。 可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和 诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西 红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1 &〇等人（1999)?1&的？1^以〇1120: 979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关I(PRl)(由水杨酸和BTH(苯并噻二 唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用 茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子(美国专利5，187,267);四环素诱导型启动子(美国专利 5,057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子?？128(0附010631398(中国专利 200710099169.7))，种子IC存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大 豆beta conglycin的启动子(Beachy等人（1985)EMB0 J.4:3047-3053))。它们可单独使用 或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止 子包括但不限于:农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止 子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:Ode 11 等人（I985)Nature 313:810; Rosenberg等人（1987)Gene，56:125;Guerineau等人（1991) Mol .Gen.Genet，262:141;Proudfoot(1991)Cell ,64:671;Sanfacon等人Genes Dev·，5: 141 ;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene ,91:151 ;Ballad等人 (1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。 [0045]可用现有的表达载体构建含有0sAPX8基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷 酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷 酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因（如胭脂碱合成酶基因 Nos)、 植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细 胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编 码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基 因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar 基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草 甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能 力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基 因，直接以逆境筛选转化植株。
[0046]上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为 PCAMBIA1300或 pANDA，也可为将 pCAMBIA1300 改造后得到的载体，如 pCAMBIA1300-35S。 [0047] B3)所述重组载体可含有序列1、序列3或序列4所示的用于编码OsAPXS的DNA序列； 进一步 B3)所述重组载体具体可为 pCAMBIA1300-35S-0sAPX8。所述 pCAMBIA1300-35S-0sAPX8为将pCAMBIA1300-35S的EcoRI和XbaI识别位点间的DNA序列替换为序列4所示的DNA 序列得到的表达序列2所示的OsAPXS的重组载体。
[0048] B16)所述重组载体可含有降低OsAPXS表达的核酸分子。在本发明的一个实施例 中，所述重组载体为pANDA-〇sAPX8i，pANDA-〇sAPX8i的LB与RB间的结构如下：
[0049] Ubiquitin启动子-反向 APX492-gus I inker-正向APX492-N0S终止子，pANDA-0sAPX8i的其他序列与pANDA相同。
[0050] 上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌具体可为农杆菌，如 农杆菌EHA105。
[0051] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0052]上述应用中，B15)所述核酸分子具体可为与序列表中序列4的第1108-1599位核苷 酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。
[0053]为解决上述技术问题，本发明还提供了 OsAPXS或所述生物材料的下述任一应用：
[0054] Hl、在培育抗病性增加或降低植物中的应用；
[0055] H2、在制备提高或降低植物抗病性产品中的应用。
[0056] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Gl或G2:
[0057] Gl、0sAPX8或所述生物材料；
[0058] G2、调控植物抗病性产品，所述产品含有0sAPX8或所述生物材料。
[0059]上述产品中，所述调控植物抗病性产品可以以OsAPXS或所述生物材料作为活性成 分，还可以将OsAPXS或所述生物材料与其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成 分。
[0060]为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ml)或M2):
[0061 ] Ml)培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入下述1)或2)得到转基 因植物；
[0062] I )0sAPX8的编码基因；
[0063] 2)含有0sAPX8的编码基因的表达盒；
[0064]所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增加；
[0065] M2)培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中0sAPX8的编码基 因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。
[0066]上述方法中，降低目的植物中OsAPXS的编码基因的表达可通过将B15)所述核酸分 子导入所述目的植物实现。
[0067] 上述方法中，OsAPXS的编码基因可为BI)所述核酸分子;所述表达盒为B2)所述表 达盒。
[0068]在本发明的实施例中，所述OsAPXS的编码基因（即序列1所示的DNA分子)通过含有 0sAPX8基因表达盒的0sAPX8基因重组表达载体导入目的植物中。所述0sAPX8基因表达盒 中，启动0sAPX8基因转录的启动子为35S。
[0069]上述方法中，其中所述OsAPXS基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以 达到更好的表达效果：
[0070] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达;例如，可根据受体植物所偏 爱的密码子，在保持本发明所述OsAPXS基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物 偏爱性;优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物 中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ;
[0071] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始;例如，利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰；
[0072] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达;所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定;尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0073] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明 基因进行连接；
[0074] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0075] 所述0sAPX8基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化 的植物组织培育成植株。
[0076] 所述方法还包括从导入序列1、序列3或序列4所示的OsAPXS的编码基因的植株中 筛选表达所述编码基因的植株，得到转基因植物。
[0077]在本发明的一个实施例中，与序列表中序列4的第1108-1599位核苷酸所示的DNA 片段反向互补的DNA分子通过pANDA载体导入所述目的植物中。
[0078]本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述OsAPXS基因转化目的植物得到 的第一代转基因植物和降低〇sAPX8表达的转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可 以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0079] 本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物;所述目的植物和所述受体植 物均可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可 为水稻。
[0080] 本发明中，所述抗病性可为抗白叶枯病。所述白叶枯病由白叶枯病菌引起，如白叶 枯病菌菲律宾小种PX099引起的白叶枯病。
[0081 ]实验证明，本发明的0SAPX8及其编码基因可以调控植物的抗病性，提高0SAPX8的 表达可以提高植物的抗病性，降低0sAPX8的表达可以降低植物的抗病性:利用白叶枯病侵 染0sAPX8表达升高的植物(转基因植株甲）与0sAPX8表达降低的植物(转基因植株乙）后发 现，接种病菌5天后转基因植株甲的病斑长度为0.5±0.3cm，显著短于野生型植株的病斑长 度（1.5±0.3cm)，转基因植株乙的病斑长度为2.3±0.2cm，显著长于野生型植株的病斑长 度（1.5 ± 0.3cm)。说明，可以利用0sAPX8及其编码基因调控植物的抗病性。
【附图说明】
[0082]图1为转基因植株的半定量RT-PCR结果。其中，泳道1-4分别为转基因植株甲的四 个株系，泳道5-8分别为转基因植株丁的四个株系，Marker表不DNA分子量标准。
[0083]图2为各转基因水稻的抗病性检测结果。其中，tAPX80X表示转基因水稻甲， tAPX8Ri表示转基因水稻乙，TP309-CK表示水稻品种"TP309"。
【具体实施方式】
[0084]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0085] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0086] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0087]下述实施例中的白叶枯病菌菲律宾小种PX099，为文献(水稻白叶枯病数量抗性座 位定位及其小种专化性.作物学报，2006,32(11) :1611-1617))中的菲律宾小种P6,经中国 农科院作物科学研究所周永力同意后，公众可从
【申请人】处获得，该生物材料只为重复本发 明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0088] 实施例1、0sAPX8可以调控水稻的抗病性
[0089]本发明提供了来源于水稻品种"TP309"的抗病相关蛋白，其名称为0sAPX8。0sAPX8 的氨基酸序列如序列表中序列2所示，OsAPXS编码基因的基因组序列如序列3所示，OsAPXS 的编码序列如序列1所，0sAPX8基因 cDNA序列如序列表中序列4所示，序列4的第31-1467位 与序列1相同。
[0090] 一、转基因水稻的构建
[0091] 1、重组载体的构建
[0092] 将pCAMBIA1300-35S的EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA 分子，保持载体的其他序列不变，得到重组载体，将该重组载体命名为PCAMBIA1300-35S-0sAPX8 dCAMBIAl 300-35S-0sAPX8能表达序列2所示的抗病相关蛋白0sAPX8。
[0093] 其中，pCAMBIA1300-35S按照如下方法制备：利用BstXI和KpnI内切酶将双元载体 pEZR_LN(由英国Glasgow 大学 John Christie 教授赠送）（The Plant Cell，2003，Vol.l5, 1781-1794)上的含355启动子的1692&口片段替换掉口041?141300的88丨乂1和恥111之间的 268bp 片段，构建成含 EcoRI-KpnI-SmaI-BamHI-XbaI 多克隆位点的 pCAMBIA1300-35S 载体。 其中，PCAMBIA1300 为 cambia 产品。
[0094] 提取水稻品种"TP309"的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，用F2和R2组成的 引 物对进行 PCR 扩增（FSW-CCAGCCGTCGAAGAGAAGGATCC-SSl^W-CACATGCCCATCCTTTTACCTC-S' ) ， 将得到的 492bp 的 PCR 扩增产物 APX492 ， 克隆到 pENTR?/SD/ D-TOPO?载体(赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific)产品），将序列正确的重 组载体命名为pENTR-〇sAPX8i;用LR Clonase II Plus Enzyme Mix，将pENTR-〇sAPX8i质粒 与pANDA载体(Proc Natl Acad Sci U S A 103,10503-10508(2006))重组，将序列正确的 重组载体命名为pANDA-〇sAPX8i。pANDA-〇sAPX8 i的LB与RB间的结构如下：Ubi qui tiη启动 子-反向 APX492_gus I inker-正向 APX492-N0S终止子，pANDA-〇sAPX8 i 的其他序列与pANDA相 同。
[0095] 将pCAMBIA1300-35S-0sAPX8导入农杆菌菌株EHA105(Plant Molecular Biology, 2003,52:957-966)中，将得到的重组菌命名为E-pCAMBIA1300-35S-0sAPX8，将 PCAMBIA1300-35S导入农杆菌菌株EHA105中，将得到的重组菌命名为E-pCAMBIA1300-35S; 将pANDA-〇sAPX8i导入农杆菌菌株EHA105中，将得到的重组菌命名为E-pANDA-〇sAPX8i，将 pANDA导入农杆菌菌株EHA105中，将得到的重组菌命名为E-pANDA。
[0096] 2、转基因水稻的构建
[0097] 通过农杆菌介导的转基因方法（Kumar e t a 1 .，200 5 )利用步骤1的E-pCAMBIA1300-35S-0sAPX8转化水稻品种"TP309"的成熟胚愈伤组织，采用50mg/L潮霉素筛 选抗性愈伤组织，然后经过预分化、分化、生根后得到To代转OsAPXS基因植株，将其命名为T0 代转基因水稻甲。利用E-pCAMBIA1300-35S转化水稻品种"TP309"，得到To代转空载体水稻， 将其命名为To代转基因水稻丙，作为对照。
[0098] 通过农杆菌介导的转基因方法（Kumar et al. ,2005)利用步骤1的E-pANDA-0sAPX8i转化水稻品种"TP309"的成熟胚愈伤组织，采用50mg/L潮霉素筛选抗性愈伤组织， 然后经过预分化、分化、生根后得到To代0sAPX8基因 RNAi植株，将其命名为To代转基因水稻 乙。利用pANDA转化水稻品种"TP309"，得到To代转空载体水稻，将其命名为To代转基因水稻 丁，作为对照。
[0099] 利用潮霉素抗性基因上的引物对（Hyg.Fd'-GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-S'与 Hyg+Rj' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3')对To代转基因水稻甲、To代转基因水稻乙、To代 转基因水稻丙与To代转基因水稻丁进行基因组水平上的鉴定，将水稻品种"TP309"作为阴 性对照，结果显示，To代转基因水稻甲、To代转基因水稻乙、To代转基因水稻丙与To代转基因 水稻丁中均含有潮霉素抗性基因，水稻品种"TP309"无含目的DNA的载体片段。
[0100] 提取To代转基因植株甲、To代转基因植株乙、To代转基因植株丙、To代转基因植株 丁和水稻品种"TP309"的叶片总RNA进行半定量RT-PCR分析，引物为F : 5 ' -gctgcgaaatactcctacg-3 ' 和R: 5 ' -AGAGGAGGTCATCAGACCATCG-3 '，采用Act in作为内参。结果 显示，转基因植株丙、转基因植株丁和水稻品种"TP309"中的OsAPXS基因的表达水平无显著 差异，0sAPX8基因在转基因植株甲中的表达显著高于水稻品种"TP309"（图1)，转基因植株 乙中几乎检测不到0sAPX8基因的表达(图1)，转基因植株乙中0sAPX8基因的表达受到抑制。
[0101] 二、转基因水稻抗病性检测
[0102] 用白叶枯病菌菲律宾小种PX099侵染正常培养至分蘖期的To代转基因植株甲、T0代 转基因植株乙、To代转基因植株丙、To代转基因植株丁和水稻品种"TP309"，检测各水稻的抗 病性，实验重复三次，具体方法如下：
[0103] 将保存-70°C的白叶枯菌菲律宾小种PX099菌种于PSA培养基（马铃薯300g/L，Ca (NO3) 2 · 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，琼脂粉 15g/L)上复壮，保存于4 °C冰箱内备用。在接种前2天在PSA平板培养基上划线培养，在28 °C培养72h，待细菌长的浓 密而均匀，用纯净水洗脱菌体，调节浓度至IO9个细胞/ml进行接种。具体接种方法参考 Kauf fman等（1973年）的接菌方法人工剪叶接种，每种水稻接种3-5个叶片，每个叶片减去顶 端3-5cm，接种两周后当病斑长度明显且稳定时进行调查，每一植株测量3-5个叶片。
[0104] 结果（图2)显示，To代转基因植株丙、To代转基因植株丁和水稻品种"TP309"的病斑 长度无显著差异，水稻品种"TP309"的病斑长度为1.5 ± 0.3cm; To代转基因植株甲的病斑长 度为0.5 ± 0.3cm，显著短于水稻品种"TP309"的病斑长度;To代转基因植株乙的病斑长度为 2.3±0.2cm，显著长于水稻品种"TP309"的病斑长度。说明，提高0sAPX8基因的表达水平可 以提高水稻对白叶枯病菌引起的白叶枯病的抗性，降低0sAPX8基因的表达水平可以降低水 稻对白叶枯病菌引起的白叶枯病的抗性，表明，0sAPX8基因可以调控水稻对白叶枯病的抗 性。
【主权项】
1. 抗病相关蛋白在调控植物抗病性中的应用；所述抗病相关蛋白是如下A1)、A2)或 A3)： A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质； A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物抗病相关的蛋白质； A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2. 与权利要求1中所述抗病相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；所 述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种： B1)编码权利要求1中所述抗病相关蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系； Β11)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物组织； Β12)含有Β2)所述表达盒的转基因植物组织； Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物器官； Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物器官； Β15)降低权利要求1中所述抗病相关蛋白表达的核酸分子； Β16)含有Β15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于:Β1)所述核酸分子为如下bl )-b5)中任一种： bl)编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子； b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子； b3)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子； b4)与bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求 1中所述抗病相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子； b5)在严格条件下与bl)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述 抗病相关蛋白的cDNA分子或基因组DNA分子； B15)所述核酸分子为与序列4所不的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子。4. 权利要求1中所述抗病相关蛋白或权利要求2或3中所述生物材料的下述任一应用： H1、在培育抗病性增加或降低植物中的应用； H2、在制备提高或降低植物抗病性产品中的应用。5. 下述G1或G2: G1、权利要求1中所述抗病相关蛋白或权利要求2或3中所述生物材料； G2、调控植物抗病性产品，含有权利要求1中所述抗病相关蛋白或权利要求2或3中所述 生物材料。6. 下述Ml)或M2): Ml)培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入下述1)或2)得到转基因植 物； 1) 权利要求1中所述抗病相关蛋白的编码基因； 2) 含有权利要求1中所述抗病相关蛋白的编码基因的表达盒； 所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增加； M2)培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括降低目的植物中权利要求1中所述抗病 相关蛋白的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：降低目的植物中权利要求1中所述抗病相 关蛋白的编码基因的表达是通过将权利要求2或3中B15)所述核酸分子导入所述目的植物 实现的； 权利要求1中所述抗病相关蛋白的编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子;所述 表达盒为权利要求2或3中B2)所述表达盒。8. 根据权利要求1-4中任一所述应用、权利要求5所述产品或权利要求6或7所述方法， 其特征在于:权利要求1-5中任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物;权利要求6或7中所 述目的植物和所述受体植物均为单子叶植物或双子叶植物。9. 根据权利要求8所述应用、所述产品或所述方法，其特征在于:所述单子叶植物为禾 本科植物。10. 根据权利要求1-4中任一所述应用，权利要求5所述产品，权利要求6或7所述方法， 或权利要求8或9所述应用、所述产品或所述方法，其特征在于： 所述抗病性为抗白叶枯病，和/或，所述白叶枯病由白叶枯病菌引起。
【文档编号】C12N15/29GK105859860SQ201610329917
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】江光怀, 翟文学, 朱立煌
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所