一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asia1型混合感染的引物、试剂盒、使用方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asia1型混合感染的RT?PCR引物、试剂盒、使用方法及其应用，所述的引物包括引物对FMDA和FMDAsia，其中，引物对FMDA包括：上游引物FMDAF：5′?GCAACCCAGATGTTGAT?3′，下游引物FMDAR：5′?CCACATGGACTATGGAA?3′，引物对FMDAsia：上游引物FMDAsiaF：5′?CTGGGTTTTACAAACCTGTG?3′，下游引物FMDAsiaR：5′?CTCTGACGTCACAATTGGC?3′。本发明试剂盒的使用方法包括患病动物新鲜样品的采集，核酸提取；反转录聚合酶链反应，琼脂糖凝胶电泳检测。该方法特异性强、灵敏度高、操作简便、省工省时，提高了检测的准确性和特异性。本发明能快速、方便的检测口蹄疫A型与Asia1型毒株或A型和Asia1型混合感染，可用于口蹄疫病毒流行病学调查与分析，具有广阔的市场应用前景和较大的经济效益。
【专利说明】
-种用于检测口蹄疫病毒A型和As i a1型混合感染的引物、试 剂盒、使用方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的引物、试剂盒、使 用方法及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫（a地thae epizooticae;foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒 引起的一种人兽共患的急性、热性、高度接触性传染病，其临诊特征是在口腔粘膜、四肢下 端及乳等处皮肤形成水瘤和烂斑。该病传播迅速，流行面广，成年动物多取良性经过，幼龄 动物多因屯、肌受损而死亡率较高。口蹄疫广泛流行于世界各地，造成了巨大的经济损失，各 国政府及国际组织高度重视，被列为全球各国共同商定扑灭的头号法定传染病。随着国际 贸易的日趋增加，物质交流和国际交往越来越频繁，给口蹄疫的预防和控制增加了难度，因 此世界各国都花费大量人力、物力和财力来研究、控制和消灭口蹄疫。
[0003] 口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus)属于微RNA病毒科中的口蹄疫病毒 属，是RNA病毒中最小的一个。口蹄疫病毒具有多型性、易变异的特点。根据其血清学特性， 可W分为7个血清型，即A、0、C、SAT1 (南非I)、SAT2(南非II型）、SAT3(南非III型）及Asia 1 型（亚洲1型）。各个血清型间无交叉免疫现象。每一个血清型又包含若干个亚型，同型各个 亚型之间也仅有部分交叉免疫性。该病毒的运种特性给口蹄疫的防制带来了许多困难。
[0004] 口蹄疫病毒在患病动物的水瘤液、水瘤皮、淋己液及发热期血液内的含量最高，其 次是各组织器官、分泌物、排泄物，可长期存在并向外排毒，退热后病毒可W出现于乳、粪、 尿、泪、诞水及各脏器中。口蹄疫病毒对外界环境的抵抗力很强，耐干燥。在自然条件下，含 毒组织及污染的饲料、饮水、饲草、皮毛及±壤等所含病毒在数日乃至数周内仍具有感染 性。口蹄疫病毒对酸和碱都特别敏感，在pH3.0和pH9. OW上的缓冲液中，病毒感染性将瞬间 消失，2 %~4 %氨氧化钢、3 %~5 %福尔马林溶液、5%氨水、0.2%~0.5%过氧乙酸或5 % 次氯酸钢等均为口蹄疫病毒良好的消毒剂。
[0005] 口蹄疫是一种传染性极强的传染病，一经发生往往呈流行性，在牧区，多呈现大流 行，疫情一旦发生，可随动物的流动迅速蔓延，经过一定时期后疫情才逐渐平息。口蹄疫可 感染多种动物，偶蹄目动物易感性最高，易感性高低的顺序依次为黄牛、奶牛、巧牛、水牛、 猪、羊、骆驼。
[0006] 对于口蹄疫的防治目前尚无特效药物疗法，主要采取综合防制措施及对症疗法。 最根本的办法是消除患病动物、带毒动物和彻底消毒，切断传播途径。因此应加强检疫和口 蹄疫监测，W防口蹄疫扩散。
[0007] 目前，根据流行病学、临诊症状和病例剖检特点可W做出口蹄疫的初步诊断，但确 诊需要进行实验室诊断。病毒的分离与鉴定和血清学诊断是实验室诊断常用的方法，但较 费时费力，耗时较长。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合 感染的引物、试剂盒、使用方法及其应用，采用本发明的试剂盒，能够在=个小时内做出诊 断，为口蹄疫临床诊断和分子流行病学调查提供一种有效的分子生物学诊断方法。
[0009] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种用于检测口蹄疫病毒A型和 As ial型混合感染的引物，所述的引物包括引物对FMDA和FMDAs ia，其中，
[0010] 引物对 FMDA:
[0011] 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'
[0012] 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3'
[0013] 引物对 FMDAsia:
[0014] 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'
[0015] 下游引物FMDAsiaR: 5'-CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。
[0016] -种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，所述的试剂盒包括引 物对FMDA和FMDAs ia，其中，
[0017] 引物对 FMDA:
[001 引上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'
[0019] 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3'
[0020] 引物对 FMDAsia:
[0021] 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'
[0022] 下游引物FMDAsiaR: 5'-CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。
[0023] 所述的试剂盒还包括5 XRT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、超纯 水、裂解液和冲洗液。
[0024] 所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
[00巧]所述的裂解液的组分为:径基哇嘟3~5% (质量分数）、憐酸S氯乙醋3.2~5.2測、 异硫氯酸苯醋1.5~3.5山1、聚乙締基化咯烧酬1.3~3.5% (质量分数）、氯化钢0.3~0.5M和 巧樣酸钢0.6~0.9M。
[00%] 所述的冲洗液的组分为：S径甲基氨基甲烧1 OiiM，乙二胺四乙酸IiiM，乙醇60~ 80% (体积分数）；抑7.0。
[0027] -种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒的使用方法，包括W下 步骤：
[0028] (1)样品的采集
[0029] (2)样品RNA的提取
[0030] (3)RT-PCR
[0031] 对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25iil:5XRT Buffer 扣l、12.5iiM dNTPs 化 l、125iiM上游引物FMDAF和125iiM下游引物FMDAR各化l、125iiM上游引物FMDAsiaF和125iiM下 游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq酶0.扣1、2.抓AU RNA酶抑制剂化1、2.5咖反转录酶化 1、超纯水3.化1和SngAU RNA化1;
[0032] RT-PCR 扩增程序为：50。[30111111，94。[3111111;94。[403,55。[453,72。[303，共35个循 环；72°C3min;
[0033] (4)RT-PCR扩增产物的检测
[0034] 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。
[0035] 所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织的采集;其中，
[0036] 固体状动物组织的采集方法为:无菌采集动物组织病料O.l-lOOmg，装入无 RNA酶 污染的离屯、管中备用；
[0037] 液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法为： 用鼻咽拭子采集鼻咽液，装入无 RNA酶污染的离屯、管中备用;血液的采集方法为:取全血、血 清或血浆IO-IOOiU，加入无 RNA酶污染的离屯、管中备用。
[0038]所述的样品RNA的提取，具体方法为：
[0039] (1)将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取；
[0040] (2)在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100iil中，加裂解 液50化1，12000巧m离屯、30s，分离出上清液；
[0041 ] (3)将上清液转入离屯、管中，加无水乙醇50化1，分次转到RNA纯化柱上，12000巧m 离屯、30s，得到粗提的RNA;
[0042] (4)用冲洗液50化1冲洗RNA纯化柱，12000巧m离屯、30s;
[0043] (5)将RNA纯化柱转到另一离屯、管，加超纯水50iil，12000rpm离屯、30s，得到病毒及 组织基因组的RNA，于-20°C保存备用。
[0044] -种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒在检测口蹄疫病毒A型 和Asial型混合感染方面的应用。
[0045] 本发明的有益效果
[0046] 1、本发明对核酸提取过程进行改进，即采用与现有试剂盒不同配方的裂解液和冲 洗液，大大缩短了核酸提取时间，使核酸的提取时间由原来的1-2小时缩短为2分钟，节省了 核酸提取的时间，从而提高了试剂盒的使用效率，使试剂盒的检验更加快捷、经济。其中，本 发明的裂解液可W使样品迅速裂解，释放出RNA。冲洗液可有效除去蛋白质、盐类及杂质等， 使所提取的RNA更加纯净。
[0047] 2、本发明W 口蹄疫病毒3D基因组序列作为目的基因区域，设计能够检测A型和 Asial型的特异性引物，同等条件下不能扩增口蹄疫其他血清型，具有很高的特异性。同时， 本发明的试剂盒具有很高的灵敏度，最低检测限为0.1 pgAU。
[004引3、本发明提供了一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，该试 剂盒能快速、准确的检测出口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染毒株。可对口蹄疫感染的A型 和Asial型单个样品检测，也可对临床病例中A型和Asial型混合感染的检测，可用于口蹄疫 病毒病原普查、分子流行病学调查及疫苗筛选和监测。
[0049] 4、本发明的方法是建立在分子生物学基础上的，检测中提供了阴性对照和阳性对 照，大大提高了检测的准确度，降低假阳性的出现几率，特异性较强，省时省力，该试剂盒将 检测时间缩短至3小时，大大提高了工作效率。
[0050] 5、本发明特别适合于口蹄疫病毒感染的大量临床样本的快速诊断，可W为临床和 科研上口蹄疫病防治和治疗提供科学依据，而且对提高口蹄疫病毒病原的检测、监控、疫苗 研制等具有重要意义。
【附图说明】
[0051 ]图1为RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中，泳道M代表化2000DNA MarkeH 从上到下依次为2000bp、1 OOObp、750bp、500bp、250bp、1 OObp )，泳道1 为口蹄疫病毒 Asial型阴性对照，2为口蹄疫病毒Asial型阳性对照，3为口蹄疫病毒Asial型样品;4为口蹄 疫病毒A型阴性对照，5为口蹄疫病毒A型阳性对照，6为口蹄疫病毒A型样品；7为口蹄疫病毒 阴性对照，8为口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染阳性对照，9为口蹄疫病毒A型和Asial型 混合感染样品。
[0化2]图2为RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中，泳道M代表化2000DNA MarkeH 从上到下依次为 2000bp、1000 bp、750bp、500bp、250bp、IOObp )，泳道 1 代表口 蹄疫病 毒A型和Asiar混合感染的样品；泳道2-6分别代表口蹄疫病毒0型、C型、SATl (南非I)、SAT2 (南非II型)及SAT3(南非HI型)样品。
【具体实施方式】
[0053] W下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0054] 本发明所用的聚乙締基化咯烧酬的相对分子量为40000。
[0化5] 本发明所用的径基哇嘟为2-径基哇嘟。
[0056] 实施例1用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒 [0化7] 1、引物的设计
[0化引根据口蹄疫病毒的3D基因组序列，设计引物对FMDA和FMDAsia,其中，
[0化9] 引物对FMDA:
[0060] 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3'(沈Q ID NO. 1)
[0061] 下游引物FMD0R:5'-CCACATGGACTATGGAA-3'(沈Q ID N0.2)
[0062] 引物对 FMDAsia:
[0063] 上游引物FMDAsiaF:5'-CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3'(沈Q ID N0.3)
[0064] 下游引物尸]\?^31曰尺:5'-(：1'口'64〔61'〔4〔441766(：-3'(569 10^.4)。
[00化]2、RNA的提取
[0066] W确诊携带口蹄疫病毒A型和AsiaI型混合感染的黄牛为实验动物，提取样品RNA， 包括W下步骤：
[0067] (1)样品的采集
[0068] 采集黄牛全血10化1，加入无 RNA酶污染的离屯、管中备用。
[0069] (2)样品RNA的提取
[0070] (a)在采集的10化1全血中，加裂解液50化1,1200化pm离屯、30s，分离出上清液；
[0071] (C)将上清液转入离屯、管中，加无水乙醇50化1，分次转到RNA纯化柱上，12000巧m 离屯、30s，得到粗提的RNA;
[0072] (d)用冲洗液50化1冲洗RNA纯化柱，12000巧m离屯、30s;
[0073] (e)将RNA纯化柱转到另一离屯、管，加超纯水50iil，12000巧m离屯、30s，得到病毒及 组织基因组的RNA，于-20°C保存备用。
[0074] 裂解液的组分为：径基哇嘟3% (质量分数）、憐酸S氯乙醋3.化M、异硫氯酸苯醋 3.5iiM、聚乙締基化咯烧酬1.3 % (质量分数）、氯化钢0.3M和巧樣酸钢0.9M。
[00巧]冲洗液的组分为：=径甲基氨基甲烧IOiiM,乙二胺四乙酸IiiM,乙醇60% (体积分 数）;抑7.0。
[0076] 3^RT-PCR
[0077] W样品RNA为模板，进行RT-PCR扩增，同时W猪水瘤病病毒为阴性对照，W 口蹄疫 病毒A型和Asia 1型混合感染为阳性对照，提取阴性对照和阳性对照样品的RNA，RT-PCR扩 增，反应体系25山：5XRT Buffer扣1、12.5咖dNTPs 5iU、125iiM上游引物FMDAF和125測下 游引物FMDAR各化1、125測上游引物FMDAsiaF和125測下游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq 酶0.化1、2.抓AU RNA酶抑制剂化l、2.5iiM反转录酶化1、超纯水3.化1和5ngAU RNA化1。 [007引 RT-PCR 扩增程序为：50°C30min，94°C3min;94°C40s，55°C45s，72°C30s，共 35 个循 环；72°C3min。
[0079] 4、RT-PCR扩增产物的检测
[0080] 取RT-PCR扩增产物扣1和Loading Buffer 5山混匀，加到含邸的1.0%的琼脂糖凝 胶中，同时加入阴性对照、阳性对照的RT-PCR扩增产物和DL2000DNA Marker，电压为120V， 电泳35min，然后在凝胶成像仪中观察结果(结果见图1)。
[0081] 实施例2用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒
[0082] 实施例2的试剂盒与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于:本实施例的裂解 液的组分为径基哇嘟5% (质量分数）、憐酸=氯乙醋化M、异硫氯酸苯醋2.5iiM、聚乙締基化 咯烧酬2% (质量分数）、氯化钢0.5M和巧樣酸钢0.6M。冲洗液的组分为S径甲基氨基甲烧10 咖，乙二胺四乙酸化M，乙醇80 % (体积分数）；抑7.0。
[0083] 本实施例W确诊携带口蹄疫病毒A型的黄牛为实验动物，W猪水瘤病病毒为阴性 对照，W 口蹄疫病毒A型为阳性对照，RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果见图1 (检测方 法同实施例1)。
[0084] 实施例3用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒
[0085] 实施例3的试剂盒与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于:本实施例的裂解 液的组分为径基哇嘟4% (质量分数）、憐酸=氯乙醋5.2iiM、异硫氯酸苯醋l.SiiM、聚乙締基 化咯烧酬3.5% (质量分数）、氯化钢0.4M和巧樣酸钢0.8M。冲洗液的组分为S径甲基氨基甲 烧1 OiiM，乙二胺四乙酸IiiM，乙醇70 % (体积分数）；抑7.0。
[0086] 本实施例W确诊携带口蹄疫病毒Asial型的黄牛为实验动物，W猪水瘤病病毒为 阴性对照，W 口蹄疫病毒AsiaI为阳性对照，RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果见图1 (检测方法同实施例1)。
[0087] 使用本发明实施例1的试剂盒提取不同样品的基因组RNA，对提取的基因组RNA的 浓度和纯度进行测定，结果见下表。
[008引表本发明试剂盒提取的基因组RNA浓度和纯度的测定结果 「OOROl
LUUW」 化：KiNAm殷半巧ng/tu ; W兀殷化但巧KiNA化ZbUnm邪ZSUnm鮮ti'、」W兀殷化但 (260/280)，通过吸光度比值来判断RNA的纯度，从上表可W看出，吸光度值在1.8~2.0之 间，说明提取的RNA纯度较好。
[0091] 表中样品1、2、3、4、5、6、7分别为使用该试剂盒从10化1血清中提取约0.96iig、1.06 ]ig、l .01]ig、l .0f5]ig、0.99iig、l .0化g、l .Olug基因组RNA。
[0092] 实验例
[0093] 1、用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒特异性实验
[0094] W确诊携带口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的黄牛为实验动物，验证本发明检 测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的RT-PCR试剂盒的特异性，包括W下步骤：
[0095] (1)样品的采集
[0096] 采集黄牛全血10化1，加入无 RNA酶污染的离屯、管中备用。
[0097] (2)样品RNA的提取(裂解液和冲洗液的配方同实施例1)
[0098] (a)在采集的10化1全血中，加裂解液50化1,1200化pm离屯、30s，分离出上清液；
[0099] (C)将上清液转入离屯、管中，加无水乙醇50化1，分次转到RNA纯化柱上，12000巧m 离屯、30s，得到粗提的RNA;
[0100] (d)用冲洗液50化1冲洗RNA纯化柱，12000巧m离屯、30s;
[0101] (e)将RNA纯化柱转到另一离屯、管，加超纯水50iil，12000rpm离屯、30s，得到病毒及 组织基因组的RNA，于-20°C保存备用。
[0102] (3)RT-PCR
[0103] W样品RNA为模板，进行RT-PCR扩增，同时Wo型、C型、SATl(南非I)、SAT2(南非II 型）及SAT3 (南非HI型）样品为对照，提取对照样品的RNA，RT-PCR扩增，反应体系25山：5 X RT Buffer 5iil、12.化M dNTPs 5iU、125iiM上游引物FMDAF和 125咖下游引物FMDAR各化 1、 125础上游引物FMDAsiaF和125咖下游引物FMDAsiaR各化1、25UAU Taq酶0.化1、2.抓AU RNA酶抑制剂化l、2.5iiM反转录酶化1、超纯水3.化1和SngAU RNA化1。
[0104] RT-PCR 扩增程序为：50°C30min，94°C3min;94°C40s，55°C45s，72°C30s，共 35 个循 环；72°C3min。
[0105] (4)RT-PCR扩增产物的检测
[0106] 取RT-PCR扩增产物扣1和Loading Buffer 5山混匀，加到含邸的1.0%的琼脂糖凝 胶中，同时加入对照的RT-PCR扩增产物和化2000DNA Marker,电压为120V，电泳35min，然后 在凝胶成像仪中观察结果(结果见图2)。
[0107] 琼脂糖凝胶电泳结果表明，本发明样品RNA的RT-PCR扩增产物在86化和2(K)bp出现 条带，对照的口蹄疫病毒Asial型扩增片段为2(K)bp，口蹄疫病毒A型扩增片段为86化P，证明 本发明RT-PCR扩增产物为口蹄疫病毒A型和Asial型目的片段，与预期相符，证明本发明RT-PCR扩增产物为口蹄疫病毒A型和Asiar混合感染目的片段。同时，对照的0型、C型、SATl (南 非I)、SAT2(南非II型)及SAT3(南非III型)样品RT-PCR扩增未出现特异性条带，说明本发明 的RT-PCR试剂盒具有良好的特异性。
[0108] 2、用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒灵敏度实验
[0109] 将提取的RNA取化g/山作10倍系列稀释，分别取化g/山、IOOngAU、IOngAU、IngAi 1、IOOpg/山、IOpgAU、IpgAU、0.1 pg/山、0.0 lpg/山、0.0 OlpgAU RNA进行RT-PCR-步法进 行扩增，结果表明本发明的最低检测限为0.1 pgAU,运比普通的RT-PCR两步法的敏感性 (IpgAU)高出 10 倍。
【主权项】
1. 一种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的引物，其特征在于，所述的引物 包括引物对FMDA和FMDAs ia，其中， 引物对FMDA: 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3' 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3' 引物对FMDAs ia: 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3' 下游引物 FMDAsiaRj' -CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。2. -种用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，其特征在于，所述的试 剂盒包括引物对FMDA和FMDAs ia，其中， 引物对FMDA: 上游引物FMDAF: 5' -GCAACCCAGATGTTGAT-3' 下游引物FMDAR: 5' -CCACATGGACTATGGAA-3' 引物对FMDAs ia: 上游引物FMDAsiaF: 5' -CTGGGTTTTACAAACCTGTG-3' 下游引物 FMDAsiaRj' -CTCTGACGTCACAATTGGC-3'。3. 根据权利要求2所述的用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，其特 征在于，所述的试剂盒还包括5XRT Buffer、dNTPs、Taq酶、RNA酶抑制剂、反转录酶、超纯 水、裂解液和冲洗液。4. 根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，其特 征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。5. 根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒，其特 征在于，所述的裂解液的组分为:羟基喹啉3~5% (质量分数）、磷酸三氯乙酯3.2~5.2μΜ、 异硫氰酸苯酯1.5~3.5μΜ、聚乙烯基吡咯烷酮1.3~3.5% (质量分数）、氯化钠0.3~0.5Μ和 朽1檬酸钠〇. 6~0.9Μ。6. 根据权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的试剂盒，其特 征在于，所述的冲洗液的组分为:三羟甲基氨基甲烷1〇μΜ，乙二胺四乙酸ΙμΜ，乙醇60~80% (体积分数）;ρΗ 7.0。7. -种如权利要求3所述的用于检测口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的试剂盒的使 用方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品的采集 (2) 样品RNA的提取 (3) RT-PCR 对样品RNA进行RT-PCR扩增，反应体系25yl:5XRT Buffer 5μ1、12.5μΜ dNTPs 5μ1、 125μΜ上游引物FMDAF和125μΜ下游引物FMDAR各ΙμL、125μΜ上游引物FMDAs iaF和125μΜ下游 引物FMDAsiaR各ΙμL、25UAU Taq酶0 · 5μ1、2· 5υ/μ1 RNA酶抑制剂ΙμL、2 · 5μΜ反转录酶ΙμL、 超纯水3.5μ1 和5ng/yl RNA 5μ1; RT-PCR 扩增程序为：5〇1€3〇111丨11，941€31^11;94 1€4〇8,551€458,721€3〇8，共35个循环；72 °C3min； (4) RT-PCR扩增产物的检测 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果。8. 根据权利要求7所述的用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的试剂盒的使用 方法，其特征在于，所述的样品的采集分为固体状动物组织的采集或液体状动物组织的采 集;其中， 固体状动物组织的采集方法为:无菌采集动物组织病料O.l-lOOmg，装入无 RNA酶污染 的离心管中备用； 液体状动物组织的采集分为分泌液的采集或血液的采集，分泌液的采集方法为：用鼻 咽拭子采集鼻咽液，装入无 RNA酶污染的离心管中备用;血液的采集方法为:取全血、血清或 血浆10-100μ 1，加入无 RNA酶污染的离心管中备用。9. 根据权利要求8所述的用于检测口蹄疫病毒Α型和Asial型混合感染的试剂盒的使用 方法，其特征在于，所述的样品RNA的提取，具体方法为： (1) 将固体状的动物组织先进行研磨处理，液体状的动物组织直接用于提取； (2) 在研磨后成糊状的动物组织20-100mg或液体状动物组织20-100μ1中，加裂解液500 μL，12000rpm离心30s，分离出上清液； (3) 将上清液转入离心管中，加无水乙醇500μ1，分次转到RNA纯化柱上，12000rpm离心 30s，得到粗提的RNA; (4) 用冲洗液500μ1冲洗RNA纯化柱，12000rpm离心30s; (5) 将RNA纯化柱转到另一离心管，加超纯水50yl，12000rpm离心30s，得到病毒及组织 基因组的RNA，于-20 °C保存备用。10. -种如权利要求2-6任一项所述的用于检测口蹄疫病毒A型和Asial型混合感染的 试剂盒在检测口蹄疫病毒A型和As ial型混合感染方面的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105861752SQ201610346010
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】李海利, 徐引弟, 朱文豪, 焦文强, 兰亚莉, 徐照学, 蔺萍
【申请人】河南省农业科学院畜牧兽医研究所