一种快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可以检测硝基还原酶的双光子荧光探针，所述荧光探针命名为3?硝基?7?二乙胺基香豆素，本发明公开的双光子荧光探针对细胞中的硝基还原酶有响应，并且随着细胞内硝基还原酶浓度的增加，荧光强度相应增强，本发明提供的探针可以通过荧光成像对肿瘤内乏氧区域的硝基还原酶进行检测。
【专利说明】
一种快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针
技术领域
[0001] 本发明涉及一种快速响应硝基还原酶（NTR)具有双光子效应的荧光探针，属于 有机小分子荧光探针领域。
【背景技术】
[0002] 乏氧是指一种组织低氧化的生理状态，通常在实体肿瘤中被观察到，是肿瘤微环 境中血管缺失或者异常的表现。临床医学研究发现，对实体肿瘤的乏氧区域的观测，与肿瘤 转移潜质和对抗治疗的恶性表征有密切联系。因此，临床研究开发进行乏氧检测的新颖方 法具有重大意义。评估肿瘤内缺氧区域的缺氧程度在预测癌症治疗的效果和相关研究中起 到重要角色。
[0003] 众所周知，乏氧可以诱导加速生物还原反应和导致细胞内还原酶的表达，如醌还 原酶，偶氮还原酶以及硝基还原酶(NTR)。其中，硝基还原酶是最具代表性的。在缺氧的状态 和电子供体烟酰胺的存在下，细胞内的硝基芳香化合物作为硝基还原酶的底物特征明显。 这种酶催化单电子还原反应被证实为一种有效的定位和成像乏氧区的设计。
[0004] 最近，已经有很多依据硝基芳香化合物酶还原设计的硝基还原酶探针，有些已经 被运用于乏氧区肿瘤细胞的成像。但是这些常见的荧光探针多有背景干扰、散射干扰等缺 陷，灵敏度不高，响应时间较长，检出限高，这样有可能影响在复杂生理环境中对硝基还原 酶检测的应用。双光子荧光探针具有近红外激发、背景干扰小、散射干扰小、灵敏度和选择 性更高，避免光漂白和光致毒现象产生，以及对生物体伤害小等优点，在生物活体分析检测 中显示出很大的优越性。
【发明内容】
[0005] 针对现有检测技术的不足，本发明提出一种快速检测硝基还原酶的双光子探针 (CN02-HY)，并对该探针进行生物成像。利用本发明检测缺氧区的硝基还原酶，对肿瘤区的 乏氧水平进行评估。
[0006] 本发明所述的快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针命名为：3_硝基-7-二乙胺 基香豆素。
[0007] 化学结构式为：
上述双光子荧光探针的合成方法如下:在1〇〇毫升圆底烧瓶中，加入10毫摩尔4-二乙胺 基水杨醛和30毫升正丁醇，室温搅拌加入下11毫摩尔硝基乙酸乙酯，然后滴加0.15毫升哌 啶和0.3毫升冰乙酸。反应体系加热回流12小时后冷却到室温，减压过滤，滤饼用乙醇重结 晶，得到产品，产率77%。
[0009] 上述探针的制备反应式如下：
实验证明，本发明所述的检测硝基还原酶的双光子荧光探针溶液，在硝基还原酶存在 下发出强烈荧光，该现象说明探针对硝基还原酶有响应，为生物成像的应用奠定了可靠的 理论基础。期待本发明能够在肿瘤缺氧区内硝基还原酶水平的检测中发挥重要作用。
[0010]
【附图说明】
[0011] 图1:探针的核磁表征:4 NMR谱和13C NMR谱； 图2:探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图。探针浓度:5 μΜ; 图3:探针检测硝基还原酶的动力学实验:其中激发波长为385 nm;探针的浓度:5 μΜ; 硝基还原酶浓度分别为0、〇. 1、〇. 25、0.5、0.75、1.5 ug/mL，测试时间：45 min，测试间隔：5 min； 图4:探针所检测硝基还原酶浓度的滴定实验;其中激发波长为385 nm;探针的浓度:5 μΜ； 图5:探针在磷酸缓冲液中的选择性。其中激发波长为385 nm;探针的浓度:5 μΜ，选择 性离子的浓度为2.5 mM; 图6:探针的单光子细胞成像应用。激发波长:405 nm和488 nm，发射波段:425 - 475 nm和500 - 550 nm; 图7:探针的双光子细胞成像应用。激发波长:760 nm，发射波段:425 - 475 nm和500 -550 nm〇
[0012] 图8:探针的双光子组织成像应用。激发波长:760 nm，发射波段:500 - 550 nm〇
【具体实施方式】
[0013] 下面通过实施例和附图对本发明进行说明。
[0014] 实施例1 化合物CN02-HY的合成 在100 mL圆底烧瓶中，加入10 mmol 4-二乙胺基水杨醛和30 mL正丁醇，室温搅拌下加 入11 mmol硝基乙酸乙酯，然后滴加0.15 mL哌啶和0.3 mL冰乙酸。反应体系加热回流12小 时后冷却到室温，减压过滤，过滤物用乙醇重结晶，得到产品，命名为：3_硝基-7-二乙胺基 香豆素，简称CN02-HY，产率77%。咕NMR谱和 13C NMR谱图如图1。
[0015] ΧΗ NMR (400 MHz, OMSO-de)： 9.02 (s, 1H), 7.72 (d, / = 9.2 Hz, 1H), 6.91 (dd, /i = 9.2 Hz, J2 = 2Λ Wz, 1H), 6.63 (d, / = 2.4 Hz, 1H), 3.53 (q, J =7.2 Hz, 4H)，1.15 (t，/= 7.2 Hz, 6H); 13C 匪R (400 MHz, DMS0-c/i；):158.86， 154.97，153.39，144.52，133.83，126.31，111.85，106.62，96.51，45.24，12.82。
[0016] 实施例2 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针的吸收光谱测试 配制1份5 mL的1 mM本发明所述检测硝基还原酶的双光子荧光探针CN02-HY的二甲基 亚砜（DMS0)溶液。分别取25 yL探针母液加入2个相同的5 mL容量瓶中，加入DMS0溶液225 yL，都加入烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH) 500 μΜ。其中一个加入硝基还原酶的磷酸缓冲 溶液（10 yg/mL，500 yL)，另一个不加。两个容量瓶都用磷酸缓冲液（PBS，pH = 7.4)定 容到5 mL，37 °C作用45 min，然后进行吸收光谱测试。结果见图2探针CN02-HY在磷酸缓冲 溶液（PBS)中的吸收曲线。探针浓度为5 yiUa):探针本身的吸收曲线；（b):探针与 0.75 yg/mL硝基还原酶作用45 min的吸收曲线。
[0017] 实施例3 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针与硝基还原酶作用的动力学测试 配制5 mL浓度为10 yg/mL硝基还原酶的水溶液及浓度为1 mM的本发明所述检测缺氧 区域硝基还原酶的双光子荧光探针母液作为备用。配制探针和硝基还原酶的溶液，其浓度 分别为 :探针5以1;硝基还原酶:0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.5以 8/111匕进行荧光检测〇(^=450 nm, λ·= 511 nm)，每隔5 min测试一次，测试45 min，记录各体系中随时间变化的焚光强 度，建立荧光强度随时间变化的标准曲线。如图3所示，反应20 min，反应体系荧光强度达到 饱和状态。所以，可以采取20 min作为反应时间。图3中，探针浓度为5 μΜ，硝基还原酶浓度 为:0 - 1.5 yg/mL，激发波长为385 nm，发射波长为511 nm，测试时间：45 min，测试间隔：5 min〇
[0018] 实施例4 不同浓度的硝基还原酶对化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针的滴定检测 配制5 mL浓度为10 yg/mL硝基还原酶的水溶液及浓度为1 mM的本发明所述检测缺氧 区域硝基还原酶的双光子荧光探针母液作为备用。
[0019] 配制探针终浓度为5 μΜ，含5 % DMS0溶液的PBS溶液，分别与不同浓度的硝基还原 酶(0 - 1.5 yg/mL)在适当温度下充分作用，进行焚光检测(Aex= 385 nm, Aem= 511 nm)， 反应时间为20 min。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与硝基还原酶浓度标准曲线。如图 4所示，随着硝基还原酶浓度的增加，反应体系荧光强度逐渐增加，当硝基还原酶浓度达到 0.75 yg/mL时，反应体系荧光强度达到饱和状态。图4中，探针浓度为5 μΜ，硝基还原酶浓度 为0 - 1.5 yg/mL，激发波长为385 nm，发射波长为511 nm。测试时间为20 min〇
[0020] 实施例5 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针对不同离子和活性小分子、氨基酸的选择性 配制1份5 mL的1 mM本发明所述检测硝基还原酶的双光子荧光探针CN02-HY的二甲基 亚砜（DMS0)溶液。配制体积为5 mL，浓度为40 mM的各种不同离子，氨基酸和活性氧，活性 氮溶液作为备用。
[0021] 在5 mL的容量瓶里加入25 yL探针母液、225 yL DMS0和500当量的各离子溶液或 1000当量的各氨基酸溶液，用磷酸缓冲液定容，摇匀后进行荧光检测(λΜ= 385 nm，λ_= 511 nm)，建立荧光强度与各离子的柱状图（结果见图5)，测试离子的浓度为2.5 mM，氨基 酸的浓度为5 mM，活性氧活性氮浓度为100 yMdO min后检测溶液的荧光发射光谱变化，由 图5可以发现，其他离子（或氨基酸）对化合物CN02-HY的荧光几乎没有影响。图5中，激发 波长为385nm;探针CN0 2-HY的浓度:5 μΜ，测试离子的浓度为2.5 mM，氨基酸的浓度为5 mM， 活性氧活性氮浓度为1〇〇 yM<a - 26号加入的离子分别是:探针CN02-HY，NADH，NaC10，H202， 过氧化叔丁基，过氧化叔丁基醇，NO (硝普酸钠），CaCl2，MgCl2，Na2S03，NaN0 2，NaHS03，NaHS， GSH，Cys，Hey，NaN03，KBr，ZnCl2，LiCl，KI，柠檬酸，乙酸钠，叔丁基氧基，.OH(羟基自由基）， NTR(含 NADH)。
[0022] 实施例6 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针的单光子细胞成像测试 将密度为3 X 105个/mL的HeLa细胞接种到灭菌的铺有盖玻片（22 mm X 22 mm) 的35 mm培养皿中，在C02培养箱(温度为37 °C，5 % C02)中分成两组培养，待细胞贴壁后，一 组在常氧条件(温度为37 °C，5 % C02)中培养;一组在乏氧条件(温度为37 °C，5 % C02，1 % 〇2)中培养，均培养12 h。向两组培养皿中加入本发明所述检测缺氧区域硝基还原酶的双光 子荧光探针，使其终浓度均为5 μΜ。继续分别在两种条件下培养0.5 h，然后将细胞培养液 吸走，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将两组细胞在单光子条件下分别拍摄荧光图像，发现在乏 氧条件下生长的癌细胞发出的荧光明显较强。（结果见图6)。 图6中，激发波长:405 nm和488 nm，发射波段:425 - 475 nm和500 - 550 nm; (a)常 氧状态培养的Hela细胞的明场成像；（b)常氧状态培养的Hela细胞在425 - 475 nm通道 的荧光成像；（c)常氧状态培养的Hela细胞在500-550 nm通道的荧光成像；（d)乏氧状 态（1 % 02)培养的Hela细胞的明场成像；（e)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞在 425-475 nm通道的荧光成像；（f)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞在500-550 nm通 道的荧光成像；（g)常氧状态培养的Hela细胞加入探针(5 μΜ)的明场成像；（h)常氧状 态培养的Hela细胞加入探针（5 μΜ)在425 - 475 nm通道的荧光成像；（i)常氧状态培养 的He la细胞加入探针(5 μΜ)在500 -550 nm通道的荧光成像；（j)乏氧状态（1 % 02)培 养的Hela细胞加入探针(5 μΜ)的明场成像；（k)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞加 入探针(5 μΜ)在425 -475 nm通道的荧光成像；（1)乏氧状态（1 % 02)培养的He la细胞 加入探针（5 μΜ)在500 -550 nm通道的荧光成像。
[0023] 实施例7 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针的双光子细胞成像测试 将实例6所培养的细胞在双光子条件下分别拍摄两组细胞的荧光照片，发现在乏氧条 件下生长的癌细胞发出的荧光明显增强(结果见图7)。 图7中，激发波长:760nm，发射波段:425 - 475 nm和500 - 550 nm; (a)常氧状态培 养的Hela细胞的明场成像；（b)常氧状态培养的Hela细胞在425 - 475 nm通道的荧光成 像；（c)常氧状态培养的Hela细胞在500 -550 nm通道的荧光成像；（d)乏氧状态（1 % 〇2)培养的Hela细胞的明场成像；（e)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞在425 - 475 nm通道的荧光成像；（f)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞在500 -550 nm通道的荧光 成像；（g)常氧状态培养的Hela细胞加入探针(5 μΜ)的明场成像；（h)常氧状态培养的 Hela细胞加入探针(5 μΜ)在425 - 475 nm通道的荧光成像；（i)常氧状态培养的Hela细 胞加入探针(5 μΜ)在500 -550 nm通道的荧光成像；（j)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela 细胞加入探针(5 μΜ)的明场成像；（k)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞加入探针(5 μΜ)在425 -475 nm通道的荧光成像；（1)乏氧状态（1 % 02)培养的Hela细胞加入探针 (5 μΜ)在500 -550 nm通道的荧光成像。
[0024] 实施例8 化合物CN02-HY双光子乏氧荧光探针的双光子组织成像测试 准备两只小鼠注射肿瘤细胞（鼠源乳腺癌细胞4T-1)，培育小鼠乳腺癌肿瘤模型，解剖 取肿瘤，并制成肿瘤切片。将一部分肿瘤切片浸泡在组织培养液中，C02培养箱(温度为37 °C，5 % C02)培育；另一部分肿瘤切片浸泡在含有浓度为5 μΜ探针溶液的组织培养液中，C02 培养箱(温度为37 °C，5 % C02)培育。半小时后，将组织培养液吸走，用PBS缓冲液冲洗3次， 将两组肿瘤组织在双光子条件下分别拍摄荧光图像，发现在加入探针的培养液中浸泡的组 织发出的荧光明显较强(结果见图8)。图8中，A)为浸泡在组织培养液的肿瘤的双光子荧光 成像;B)为浸泡在含有5μΜ探针溶液的组织培养液中的肿瘤双光子荧光成像。
【主权项】
1. 一种快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针，其 化学结构式为：命名为:3-硝基-7-二乙胺基香?素。2. 根据权利要求1所述的双光子荧光探针，其特征在于，由以下方法合成:在100毫升圆 底烧瓶中，加入10毫摩尔4-二乙胺基水杨醛和30毫升正丁醇，室温搅拌加入下11毫摩尔硝 基乙酸乙酯，然后滴加0.15毫升哌啶和0.3毫升冰乙酸，反应体系加热回流12小时后冷却到 室温，减压过滤，滤饼用乙醇重结晶，即得。
【文档编号】C09K11/06GK105884734SQ201610471060
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】林伟英, 刘展榕, 徐安, 唐永和
【申请人】济南大学