用于治疗剂的效价测定的制作方法
【专利摘要】本文提供了测定治疗剂的致耐受潜力的方法，所述方法包括测定所述治疗剂增加抗原呈递细胞诸如单核细胞、巨噬细胞、B细胞和树突状细胞表达致耐受性标志物例如PD?L1的能力。
【专利说明】用于治疗剂的效价测定 发明领域
[0001 ]本发明提供测定治疗剂的致耐受性和/或效价的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 目前，使用不同的测试方法，诸如针对感染或疾病的物理化学性质、抗原性、免疫 原性、感染性测定和预防，测量治疗剂的效价。本申请依赖于治疗剂性质和测试目的。例如， 就疫苗而言，效价通常通过测量靶动物物种或另一个物种(如小鼠或大鼠）中的免疫应答来 测定。
[0004] 前述报告指出，自体免疫疾病的T细胞免疫疗法，如利用减毒自体反应性T细胞进 行疫苗，通过提高对自体反应性T细胞的抗独特型和/或抗工效型活性诱发调节性免疫应答 以控制异常自体免疫应答。据认为，自体抗原特异性T细胞的施用可引发独特的旁分泌信 号，这促进了抗原呈递细胞(APC)和/或效应子T细胞的致耐受性网络，从而协助控制与自体 免疫紊乱相关的炎症。因此，测定此类基于T细胞的治疗剂的效价需要测量调节性免疫应答 的诱导。
[0005] 需要能够测量治疗剂(尤其是诱导调节性免疫的治疗剂)的效价的高通量、优选体 外测定。
[0006] 发明概述
[0007] 本文公开了评估治疗剂的效价的方法，该方法包括测定治疗剂的致耐受性。测定 治疗剂的致耐受性的方法通常包括以下步骤:使治疗剂优选体外接触包含测试抗原呈递细 胞的试样;测量接触治疗剂的测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达；以及 将测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达与适当的对照比较;其中与对照抗 原呈递细胞相比，测试抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达增加确定治疗剂具 有致耐受性。在优选的实施方案中，至少一个致耐受性标志物包含ro-i配体，如ro-Li。在优 选的实施方案中，测量步骤在接触步骤后约24-72小时内，更优选地在约48-72小时内，最优 选地在约72小时内进行。在一个实施方案中，治疗剂的效价与治疗剂的致耐受性直接相关。
[0008] 在一个实施方案中，将治疗剂施用于需要其的患者，使患者对特定的试剂耐受化， 如下调患者对该抗原诸如过敏原或自体抗原的免疫应答。在一个实施方案中，治疗剂选自 过敏原、其耐受化表位、包含过敏原特异性免疫细胞的疫苗、包含过敏原特异性免疫细胞的 片段疫苗以及编码过敏原或其耐受化表位的核酸。优选地，治疗剂选自自体抗原、其耐受化 表位、包含自体抗原特异性免疫细胞的疫苗、包含自体抗原特异性免疫细胞的耐受化片段 的疫苗以及编码自体抗原或其耐受化表位的核酸。
[0009] 在一个示例性优选的实施方案中，治疗剂包含自体抗原特异性T细胞，其中自体抗 原优选地选自髓鞘蛋白（如，髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白）、水通 道蛋白4以及血小板糖蛋白Ilb-IIIa和Ib-IX。最优选地，治疗剂包含髓鞘蛋白特异性减毒T 细胞。在另一个实施方案中，T细胞与测试和对照抗原呈递细胞是异体的。在某些优选的实 施方案中，T细胞与测试和对照抗原呈递细胞是自体的。
[0010] 在优选的实施方案中，包含抗原呈递细胞的测试和/或对照样品包括单核细胞、树 突状细胞、B细胞和/或衍生自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或B细胞的细胞系。在一些实 施方案中，抗原呈递细胞包括衍生自单核细胞(如，U937、THP-1等）的细胞系。优选地，测试 和对照抗原呈递细胞包括B细胞。最优选地，测试和对照抗原呈递细胞包括单核细胞。
[0011] 在一个实施方案中，至少一个致耐受性标志物与抗原呈递细胞的至少一个标志物 (诸如CD86)-起组合测量。更优选地，使用检测致耐受性标志物以及任选地抗原呈递细胞 标志物的高通量方法。最优选地，使用流式细胞分析实时检测抗原呈递细胞上至少一个致 耐受性标志物(如，PD-L1)和抗原呈递细胞标志物(优选地⑶86)的细胞表面表达。
[0012] 本文还提供了测定治疗剂的致耐受性的试剂盒，该试剂盒包括致耐受性标志物的 抗体和抗原呈递细胞标志物的抗体。优选地，该试剂盒还可包括检测一个或多个抗体的检 测试剂和/或使用该试剂盒的说明。
【附图说明】
[0013 ]图1示出了流式细胞点图，该图示出了在(A)单独或⑶存在TCELNA睡的情况下 孵育时，自体淋巴细胞（CD86' X-轴）或自体单核细胞(CD86，X-轴）的细胞表面PD-L1表达 (y-轴)。
[0014] 图2示出了在单独（)或存在自体T细胞的情况下（□)孵育时，五个独立的 TC E LN A?产品(X-轴)的细胞表面表达ro-Ll的单核细胞的百分比(y-轴）。
[0015] 图3示出了在与自体T细胞一起孵育后，五个独立的TCELN A⑧产品（X-轴）的结 合荧光抗H)-L1抗体的单核细胞的平均荧光强度(MFI，y-轴)倍数变化。
[0016] 图4示出了在单独或与T细胞一起孵育（A) 24小时或（B) 72小时后，异体 TCELNA?产品的细胞表面表达H)-L1的免疫细胞的百分比(y-轴）。
【具体实施方式】
[0017] 据信，抗原呈递细胞(APC)尤其是专职性抗原呈递细胞，在辐照相互作用时，凋亡 细胞(诸如减毒自体反应性T细胞)能够经历显著的表型和致耐受性变化。在辐照暴露后，自 体白细胞、树突状细胞显示出致耐受特性，包括IL-10的分泌增加以及未暴露的T细胞增殖 的刺激修复（Zheng DH等（2010)Biochem Biophys Res Commun.395(4) :540-6)。此外，HIV 慢性病毒感染导致各种细胞类型上PD-L1的表达增加，单核细胞分泌IL-10以及T细胞扩增 抑制（Said ΕΑ等(2010)Nat ]^(1.16(4):452-9)。1'细胞扩增和功能通过例如^)-1^和^)-1之 间以及IL-10R和IL-10之间的相互作用的阻断恢复，暗示涉及PD-L1和/或IL-10、它们在各 自途径中各自的受体和其它分子的相互作用可作为耐受性诱导的有效标志物。
[0018] 如本文所用，致耐受性标志物可包括这样的蛋白质：其上调表达可立即通过接触 耐受化剂的抗原表达细胞检测。例如，包含ro-i配体(优选地ro-Li)的致耐受性标志物的表 达可在接触耐受化剂后24小时、48小时或72小时内，优选地48小时内，最优选地24小时内检 测。
[0019]在多发性硬化中，ro-Ll的APC表达减少和促炎性细胞因子的分泌增加与MS患者的 进展相关(Kami A.等（2006)J Immunol .177(6) :4196-202)。相反，用IFN-β疗法治疗MS显 著增加了单核细胞和DC上的H)-L1表达，并且显著抑制了自体⑶4T细胞活化(Schreiner B (2004)J Neuroimmunol.155:172-182·)。
[0020] TCELNA銳是多发性硬化(MS)的τ细胞免疫疗法，它由从个体的外周血单核细胞 扩增的自体髓鞘反应性Τ细胞库构成。如本文所公开，TCELNA?产品的效价可通过监测 抗原呈递细胞对TCELNA?暴露作出的应答而表达的PD-L1来测试。具体地讲，作为与 TCELNA?产品一起培养作出的应答，PD-L1表达在应答者单核细胞中诱导。
[0021] 这些上述观察结果支持抗原呈递细胞的致耐受性标志物如包含ro-i配体(如，pd- L1)的致耐受性标志物的表达检测作为治疗剂的致耐受性测定方法。
[0022]治疗剂
[0023]因此，在一个方面，本发明提供用于测定治疗剂的致耐受性的方法。如本文所用， 术语"致耐受性"是指治疗剂"耐受化"或诱导对特定抗原的"耐受性"的能力。术语"耐受性" 是指对具体抗原的适应性免疫应答如T细胞和/或抗体应答的减少。对具体抗原的免疫应答 的减少可伴随着免疫调节细胞如抗独特型和/或抗工效型免疫细胞的特殊子集的敏感化 和/或应答增加。
[0024]技术人员将认识到，治疗剂的致耐受性可与治疗剂的效价相关。如本文所用，"效 价"是指治疗剂在施用后产生所需效果的能力。
[0025]在优选的实施方案中，治疗剂的所需效果是对特定抗原(如，过敏原、自体抗原）的 免疫应答的耐受化。在这些实施方案中，治疗剂的致耐受性与其效价直接相关。在优选的实 施方案中，使用本文公开的方法测定治疗剂的效价，以试图诱导对过敏原或自体抗原的耐 受性。
[0026] "过敏原"是可引起受试者的不期望的（如，1型超敏)免疫应答（即，变应性应答或 反应)的任何物质。过敏原包括但不限于:植物过敏原(如，花粉、豚草过敏原）、昆虫过敏原、 昆虫螫伤过敏原（如，蜜蜂螫伤过敏原）、动物过敏原（如，宠物过敏原，诸如动物皮毛或猫 Fel d 1抗原）、乳胶过敏原、霉菌过敏原、真菌过敏原、化妆品过敏原、药物过敏原、食物过 敏原、粉尘、昆虫毒液、病毒、细菌等。食物过敏原包括但不限于:乳过敏原、蛋过敏原、坚果 过敏原（如，花生或木本坚果过敏原等(如，胡桃木、腰果等））、鱼过敏原、贝类过敏原、大豆 过敏原、豆类过敏原、种子过敏原和小麦过敏原。昆虫螫伤过敏原包括作为蜜蜂螫伤、黄蜂 螫伤、大胡蜂螫伤、胡蜂螫伤等的过敏原或它们相关的过敏原。昆虫过敏原还包括屋尘螨过 敏原(如，Der P1抗原)和蟑螂过敏原。药物过敏原包括作为抗生素、NSAID、麻醉剂等的过敏 原或它们相关的过敏原。花粉过敏原包括草本过敏原、木本过敏原、杂草过敏原、花过敏原 等。"变态反应相关的过敏原"是单独或与其它过敏原组合产生不期望的免疫应答而导致， 或临床医生预期导致受试者的变应性应答或反应或变应性应答或反应的症状的过敏原。
[0027] "自体抗原"是通常导致组织损伤和/或自体免疫疾病的自体体液(B细胞)或T细胞 介导的免疫应答靶向的身体中正常组织成分。如本文所用，"自体"是指细胞或组织衍生自 免疫相容的相同个体或细胞或组织，如具有相同的MHC/HLA单倍型。如本文所用"异体"是指 细胞或组织是通常相异的并且是免疫不相容的，如具有不同的MHC/HLA单倍型。自体抗原的 非限制性实例包括髓鞘蛋白（如，髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞蛋白）、 水通道蛋白4、血小板糖蛋白Ilb-IIIa和Ib-IX、胰岛素、胰岛素原、谷氨酸脱羧酶(GAD)、 GAD65、GAD67、热激蛋白65(hsp65)、胰岛细胞抗原69(ICA69)、胰岛细胞抗原相关蛋白酪氨 酸磷酸酶(PTP)、GM2-1神经节苷脂、Tep69、胰岛细胞蛋白酪氨酸磷酸酶及其衍生的37-kDa 自体抗原(包括IA-2)、phogrin、人软骨细胞糖蛋白-39、胶原、II型胶原、软骨链蛋白、埃兹 蛋白、根蛋白、膜突蛋白、分枝杆菌热激蛋白6、桥粒芯糖蛋白、i3-2-GPI、Ku(p70/p80)自体抗 原或其80-kd亚基蛋白、核自体抗原La(SS-B)和Ro(SS-A)、蛋白酶体β-型亚基C9、中心体自 体抗原PCM-1、多肌炎-硬皮病自体抗原(PM-Scl)、自体抗原CENP-A、U5、核仁U3-和Th(7-2) 核糖核蛋白、核糖体蛋白L7、hPopl、核基质抗原的36-kd蛋白、甲状腺过氧化物酶和促甲状 腺激素受体、人TSH受体、乙酰胆碱受体、肌肉受体激酶或任何其它合适的自体抗原的成分。
[0028] 技术人员将易于认识到，试图诱导对过敏原或自体抗原的耐受性的治疗剂包括但 不限于:全长过敏原或全长自体抗原;过敏原的耐受化表位或自体抗原的耐受化表位;包含 可为减毒的、过敏原或自体抗原特异性的或对其产生应答的免疫细胞的疫苗;包含过敏原 或自体抗原特异性的或对其产生应答的免疫细胞的耐受化片段（如，T细胞受体、B细胞受 体、其衍生物等）的疫苗，以及包含编码过敏原、自体抗原、其耐受化表位的核酸（如，DNA或 RNA)和过敏原或自体抗原特异性的和/或对其产生应答的免疫细胞的耐受化片段的疫苗。 如本文所用，过敏原或自体抗原的耐受化表位可包括但不限于:分别地过敏原或自体抗原 的片段、融合蛋白、肽模拟型和修饰肽。
[0029] "表位"也称为抗原决定簇，是免疫系统尤其是例如抗体、B细胞或T细胞识别的抗 原(如，过敏原、自体抗原）的一部分。表位通常由可见于有核细胞的MHC或HLA分子呈递至免 疫细胞。在一些实施方案中，表位本身是抗原。
[0030] 在一个实施方案中，治疗剂试图诱导对自体抗原的耐受性。在优选的实施方案中， 自体抗原选自髓鞘蛋白、水通道蛋白-4和血小板糖蛋白Ilb-IIla和Ib-IX。在更优选的实施 方案中，自体抗原是选自髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白和髓鞘少突胶质细胞蛋白的髓鞘蛋 白。优选地，试图诱导对自体抗原的耐受性的治疗剂包含减毒T细胞，其中该T细胞是自体抗 原特异性的。
[0031] 在一个实施方案中，治疗剂的所需效果是活化对特定抗原的免疫应答。此类治疗 剂包括病原性抗原、肿瘤抗原、病原性抗原的片段、肿瘤抗原的片段、编码病原性抗原的核 酸以及编码肿瘤抗原的核酸是本领域熟知的。熟知的肿瘤抗原的非限制性实例包括作为癌 抗原的细胞角蛋白，尤其是细胞角蛋白8、18和19;上皮细胞膜抗原(EMA);人胚抗原(HEA- 125);人乳脂肪球、MBrl、MBr8、Ber-EP4、17-lA、C26和T16;作为肌源性肉瘤的抗原的肌间线 蛋白和肌肉特异性肌动蛋白；作为滋养层和生殖细胞肿瘤的抗原的胎盘碱性磷酸酶、人 绒毛膜促性腺激素和胎儿球蛋白；作为前列腺癌的抗原的前列腺特异性抗原；结肠腺癌 的癌胚抗原;作为黑素瘤的抗原的ΗΜΒ-45;以及作为神经内分泌和神经外胚层肿瘤的抗原 的嗜铬粒蛋白-Α和突触小泡蛋白。在这些实施方案中，治疗剂的致耐受性不与治疗剂的效 价直接相关，相反，治疗剂的致耐受性可与其效价负相关。
[0032] 抗原呈递细胞、致耐受性标志物及其测量
[0033] 如本文所公开，本文公开的治疗剂的致耐受性的测定方法通常包括使治疗剂接触 抗原呈递细胞以及测量抗原呈递细胞的至少一个致耐受性标志物的表达。
[0034] 如上文所讨论，表位通常由可见于有核细胞的MHC或HLA分子呈递至免疫细胞。换 句话讲，所有有核细胞均能够使用I类分子呈递抗原。然而，一些表位由可见于专职性抗原 呈递免疫细胞，诸如可见于巨噬细胞、单核细胞、Β细胞、树突状细胞以及由其衍生的细胞系 的MHC或HLA分子呈递至免疫细胞。在一个优选的实施方案中，本文公开的方法包括测量专 职性抗原呈递细胞的致耐受性标志物的表达。在优选的实施方案中，测量包括单核细胞、巨 噬细胞、B细胞或由其衍生的细胞系的抗原呈递细胞的致耐受性标志物的表达。更优选地， 测量包括巨噬细胞、单核细胞和/或由其衍生的细胞系（如，U937或THP-1细胞系）的抗原呈 递细胞，最优选地单核细胞的致耐受性标志物的表达。
[0035]患有继发进展型多发性硬化(SP-MS)的个体的抗原呈递细胞(APC)的表型与患有 复发-缓解型多发性硬化(RR-MS)的个体或健康对照的比较研究暗示，患有自体免疫疾病的 个体的APC偏向于特征为PD-L1表达减少和炎症介质的分泌增加的炎性应答(Karni A等 (2006) J. Immunol. 177(6) :4196-202.)。然而，用IFN-β疗法治疗显著增加了单核细胞和DC 上的PD-L1表达，并且赋予DC更多致耐受性/调节性，这由在继代培养时它们不能诱导自体 CD4T细胞活化支持(Schreiner B等(2004) J.Neuroimmunol .155:172-182·)。这些数据共同 暗示，SP-MS患者中PD-L1表达的诱导有助于恢复SP-MS患者中不正常的致耐受性/调节性网 络，显示了新的治疗目的。如本文所公开，暴露至TCELNA?显著诱导了单核细胞中的H)- L1表达，暗示抗原呈递细胞的致耐受性标志物诱导可作为产品效价以及作用机制二者的指 不。
[0036]因此，在一个实施方案中，测量致耐受性标志物Η)-1配体(如，PD-L1、PD-L2等）的 表达。在一个实施方案中，测量抗原呈递细胞的ro-Li表达。在另一个实施方案中，PD-1配体 的表达在抗原呈递细胞接触治疗剂后72小时内测量。优选地，抗原呈递细胞的ro-i配体表 达在抗原呈递细胞接触治疗剂后约24小时测量。存在多种本领域的普通技术人员已知的检 测抗原呈递细胞的致耐受性标志物表达的测定形式。参见例如Harlow和Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988年。作为非限制性实例，致 耐受性标志物蛋白的检测可使用结合蛋白质并且优选地被可检测标记(如，放射性标记、发 光标记、荧光标记、酶等）的抗体进行。抗原呈递细胞的致耐受性标志物蛋白表达可根据熟 知的方法或测定，如免疫沉淀、ELI SA、蛋白质印迹分析、免疫组织化学、免疫荧光、"夹心"免 疫测定、免疫放射测定、凝聚扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、沉淀反应、凝集 测定、补体结合测定、蛋白A测定、免疫电泳测定、焚光活化细胞分选(FACS)分析、放射性免 疫测定、试纸检验、即时检验等等检测特异性抗体结合的致耐受性标志物来测量。在一些实 施方案中，利用自动化检测测定。用于免疫测定自动化的方法包括美国专利No. 5，885，530、 4,981，785、6,159,750和5,358,691中描述的那些，每个专利以引用的方式并入本文。在一 些实施方案中，分析和结果展示也是自动化的。
[0037] 抗原呈递细胞的致耐受性标志物(包括细胞表面蛋白，如，PD-L1)的表达可通过荧 光活化细胞分选测量。或者，包括细胞因子的致耐受性标志物的表达可使用熟知的免疫分 析法，优选地ELISA测量。
[0038] 为提高灵敏度，可在给定的样品中测定多个标志物。具体地讲，一个或多个其它致 耐受性标志物可与抗原呈递细胞的标志物组合测定。抗原呈递细胞的细胞表面标志物的实 例包括但不限于：MHC I类、MHC II类、CDl、CD2、CD3、CD4、CD8、CDllb、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、 CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARC0、DEC-205、甘露糖受体、朗格汉斯蛋 白、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受体和IL-2受体、ICAM-1、Fc γ受体或抗原呈递细胞相对 特异性表达的其它受体。树突状细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于:MHC I类、MHC 11类、。01、0)2、0)3、0)4、0)8、0)1113、0)14、〇015、0)16、0)19、0)20、0)29、0)31、〇040、0)43、 CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、 CD40、BDCA-2、MARC0、DEC-205、甘露糖受体、朗格汉斯蛋白、DECTIN-l、B7-l、B7-2、IFNγ受 体和IL-2受体、ICAM-l、Fc γ受体或树突状细胞相对特异性表达的其它受体。单核细胞/巨 噬细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于:CD14、⑶32、⑶68、⑶115、⑶83、p55、⑶40和 CD863细胞的细胞表面标志物的实例包括但不限于:B220/CD45R、CD19、CD21、CD24、CD37、 CD38、CD40、CD80和CD86。
[0039] 组合测定可同时或按顺序进行。可根据常规实验选择标志物，以确定产生最佳灵 敏度的组合。在优选的实施方案中，抗原呈递细胞的细胞表面致耐受性标志物和细胞表面 标志物使用荧光活化细胞分选和/或流式细胞分析同时测量。更优选地，PD-L1和CD86的细 胞表面表达通过流式细胞分析同时测量。
[0040] 在优选的实施方案中，在试样（即，接触治疗剂的抗原呈递细胞）的至少一个致耐 受性标志物的表达测量中，测试抗原呈递细胞的检测表达水平通常可与对应和适当的对照 样品（即，抗原呈递细胞，优选地测试抗原呈递细胞自体的，不接触治疗剂）的检测表达水平 进行比较。在优选的实施方案中，与对照抗原呈递细胞相比，测试抗原呈递细胞的致耐受性 标志物表达水平和/或表达致耐受性标志物的测试抗原呈递细胞的数量的相对增加与治疗 剂的致耐受性和/或效价直接相关。
[0041] 试样抗原呈递细胞的致耐受性标志物表达水平和/或表达致耐受性标志物的测试 抗原呈递细胞的百分比可以相对于对照样品的倍数增加（如，可检测表达水平增加3倍）的 方式测量，和/或表达致耐受性标志物的细胞的百分比可视为致耐受性水平为3(可检测表 达水平增加5倍），和/或表达致耐受性标志物的细胞的百分比可视为致耐受性水平为5(相 对于对照增加10倍），可视为致耐受性水平为1〇(相对于对照增加100倍），可视为致耐受性 水平为100等。在一个实施方案中，如果治疗剂的致耐受性水平为至少约3，如至少约5，如至 少约10，如至少约20，如至少约100，则确定治疗剂具有致耐受性。
[0042] 本文还描述了用于测定治疗剂的致耐受性的试剂盒。此类试剂盒通常包括进行效 价测定必须的两种或更多种组件。组件可以是化合物、试剂、容器、说明和/或设备。例如，试 剂盒内的一个容器可包含致耐受性标志物特异性抗体和抗原呈递细胞标志物特异性抗体。 此类试剂盒还可包含上述检测试剂，该试剂包含适于抗体结合的直接或间接检测的报告基 团。
[0043] 因此，本文描述了用于测量抗原呈递细胞的致耐受性标志物表达水平的试剂盒， 该试剂盒可用于提供适于测定治疗剂的致耐受性和/或效价的结果。试剂盒可包括致耐受 性标志物的抗体，该抗体可任选地被可检测标记，如放射性标记、发光标记、荧光标记、酶 等。用于可检测标记蛋白的方法是本领域熟知的。此类试剂盒还可包括抗原呈递细胞的标 志物特异性的检测试剂。使用试剂盒进行评估的说明，包括用于定量和/或评估具体治疗剂 的语境中此类致耐受性标志物的水平的适当比较标准，也可有利地以印刷形式提供和/或 记录在合适的介质上。
[0044] 实施例
[0045] 实施例1:作为抗原呈递细胞来源的PBMCS [0046] 实施例1.1 :材料和方法
[0047]用于效价测定的应答者细胞从聚蔗糖分离的PBMC的冷冻储液获得。将PBMC解冻、 洗涤并重悬于培养基中，然后暴露于TCELNA?产品。
[0048] 从液氮存储器取出TCELNA?产品，在37°C水浴中解冻。样品在配制用于效价测 定后立即辐照和使用。应答者PBMC(1X106)单独或与TCELNA:?(1X106)组合在聚丙烯管 中培养3天。在培养1或3天后，酌情通过流式细胞术监测⑶14+CD19-⑶3-单核细胞的ro-Ll、 〇095、卩01、〇)86、1^6-3、11^-6、比-4、11^-10、11^-23、11^-113、11^-27、11^-21和/或11^-22表达。使 用同种型匹配mAb检验H)-L1染色的特异性(数据未示出）。
[0049] 实施例1.2:结果
[0050] 基于单核细胞的效价测定证明TCELNA?赋予具有诱导PD-L1表达标志的应答 者单核细胞致耐受性/调节性表型。由于暴露至TCELNA?产品，单核细胞表型的生产性 调节使ro-Ll表达在>90%的单核细胞上。在所示数据中，基于⑶14表达鉴定单核细胞。在不 存在TCELNA_?的情况下，如在PD-L1阳性级分中不超过15 %的细所证明，（PBMC单独培 养)单核细胞不能表达PD-L1(图1A和2)。相比之下，PBMC与TCELNA?产品一起培养使至 少60 %的单核细胞表达PD-L1 (图1B和2)，暗示有效诱导了致耐受性/调节性表型。图2显示 在暴露于5种独立患者产品后诱导PD-L1在单核细胞上表达。图3显示在与五种不同 TCELNA⑩产品一起孵育后由单核细胞导致的平均荧光强度的倍数增加。综上所述，所述 数据表明暴露至TCELNA?产品的单核细胞在体外经历了其调节性标志物H)-L1表达的 根本变化，该标志物也可表征产品的体内作用机制。
[0051] 在测试异体抗原呈递细胞中，配制和辐照的TCELNA?产品与异体应答者PBMC 群体以1:1的比率合并。在24和72小时后，收集培养物并使用流式细胞术评估应答者细胞群 体上的ro-Ll表达。图4显示了仅应答者和应答者+TCELNA?(+Tc)条件的ro-Ll表达百分 比。配对独立样品的Wilcox秩和检验证明在24和72小时(分别p〈0.004和p〈0.00002)单核细 胞上的PD-L1表达显著上调，分别参见图4A和图4B。对B细胞和T细胞上PD-L1表达的类似分 析还显示，在B细胞群体培养72小时后H)-L1表达显著减少(p〈0.003)，但在任何一个时间点 T细胞未减少ro-Li。
[0052] 在辐照的TCELNA?产品孵育后约24小时分析由单核细胞进行的PD-L1XD95、 ?01丄086、1^6-3的细胞表面表达和11^-6、几-4、11^-10、11^-23、11^-113、11^-27、11^-21和11^-22 的细胞因子表达。在所测试的标志物中，仅PD-L1表达由单核细胞显著增加。在不存在 TCELNA?产品的情况下孵育24小时后，小于1%的单核细胞表达H)-L1。相比之下，在与 TCELNA?产品一起孵育24小时后，平均97.8%的单核细胞表达H)-L1 (n = 4)。
[0053] 实施例2:作为抗原呈递细胞来源的细胞系
[0054] 将配制和辐照的TCF丄NA⑧产品的细胞与U937或THP-1细胞以1:1的比率合并。 在24和72小时后，收集培养物并使用流式细胞术评估U937或THP-1细胞上的H)-L1表达。预 期在与TCE〖LN A?产品一起孵育后，U937或THP-1细胞对PD-L1的表达增加。
[0055] 本文提及的所有专利和专利公布据此以引用的方式并入。
[0056] 本领域的技术人员在阅读前述后将进行某些修改和改进。应当理解，为简明和清 晰，所有此类修改和改进已从本文删除，但适当地在以下权利要求的范围内。
【主权项】
1. 一种测定治疗剂的致耐受性的方法，所述方法包括： a. 使所述治疗剂体外接触包含测试抗原呈递细胞的试样； b. 测量接触所述治疗剂的所述测试抗原呈递细胞对包括PD-I配体的至少一个致耐受 性标志物的表达，其中所述测量步骤在所述接触步骤后72小时内进行；以及 c. 将所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志物的表达与适当的对照比 较； 其中与对照抗原呈递细胞相比，所述测试抗原呈递细胞对所述至少一个致耐受性标志 物的表达增加确定所述治疗剂具有致耐受性。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述测量步骤在所述接触步骤后约24小时进行。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包含T细胞，并且所述测试和对照抗原 呈递细胞是所述T细胞自体的。4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述治疗剂包含T细胞，并且所述测试和对照抗原 呈递细胞是所述T细胞异体的。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞对选自由过敏原和自体抗原组成的组的 抗原具有反应性。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述T细胞对自体抗原具有反应性。7. 根据权利要求5所述的方法，其中所述自体抗原选自由髓鞘蛋白、水通道蛋白或血小 板糖蛋白组成的组。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述髓鞘蛋白选自由髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白 和髓鞘少突胶质细胞蛋白组成的组。9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述PD-I配体是PD-Ll。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括单核细胞。11. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括B细胞。12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突状细胞。13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测量步骤包括将所述测试和对照抗原呈递细 胞与所述致耐受性标志物特异性抗体一起孵育，并且测量结合至所述测试和对照抗原呈递 细胞的抗体的量。14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述抗体用可检测标记进行标记。15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体通过流式细胞术检测。16. -种试剂盒，其用于测定包括抗体的治疗标志物对致耐受性标志物和抗体对抗原 呈递细胞标志物的致耐受性。
【文档编号】C12Q1/68GK105960468SQ201580005416
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】D·西雷, L·W·克里森
【申请人】欧普萨治疗股份有限公司