一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗的制作方法

一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗。该融合蛋白为肺炎链球菌毒力蛋白基因和蛋白连接器基因重组后的表达产物，肺炎链球菌毒力蛋白为Ply、PspA、PsaA、PcpA或PhtD。本发明肺炎链球菌融合蛋白疫苗鼻腔免疫动物后不仅能够诱导出高效价的血清特异性IgG抗体，也能诱导出高效价的局部粘膜特异性IgA，并且对不同肺炎链球菌菌株的鼻腔攻毒都有很好的保护性作用。
【专利说明】
一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗。
【背景技术】
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)是一种有荚膜的革兰氏阳性菌，该菌通 常定植于健康人群的口腔和鼻咽部，是正常菌群中的一种；当人体免疫力低下时，肺炎链球 菌局部浸润引起鼻窦炎、中耳炎，吸入肺引起肺炎，还可以侵袭机体引起菌血症和脑膜炎等 疾病。WHO估计全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病，其中五岁以下儿童约有100万左 右，占该年龄组总死亡率的11 %。
[0003] 现在市场上销售的肺炎链球菌疫苗是基于肺炎链球菌荚膜多糖抗原的疫苗，SP23 价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗和荚膜多糖-蛋白结合疫苗。肺炎链球菌荚膜多糖是肺炎链球 菌主要的毒力因子，它的结构存在着变异性，根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原与抗体反应的 差别，肺炎链球菌被分为多种不同的血清型，现在已经鉴定出90多个不同的血清型。因此， 无论是荚膜多糖疫苗还是荚膜多糖-蛋白结合疫苗都很难将90多个血清型覆盖。23价荚膜 多糖疫苗是非T细胞依赖性的，免疫后不能引起免疫细胞的免疫记忆性，对免疫系统发育尚 未完全的婴幼儿免疫效果较差，而婴幼儿却是肺炎链球菌感染的易感人群，该疫苗主要应 用于成年人;肺炎链球菌多糖-蛋白结合疫苗将荚膜多糖偶联到蛋白载体上，免疫机体后可 以引起针对多糖的T细胞依赖性的免疫应答并且可以诱导免疫记忆性，但是需要将每一种 荚膜多糖都要偶联到蛋白载体上，由于偶联技术复杂导致疫苗价格高昂，很难在全球广泛 应用。由于肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的使用，已经出现了血清型替代现象，也就是非疫苗组 分的血清型菌株发病数量在上升。从长远角度来看，新的血清型肺炎链球菌流行株将会不 断出现而替代旧的流行株，因此现有疫苗的效用将会越来越低。因此，研发一种更具广谱性 保护、生产成本低廉的肺炎链球菌疫苗是非常重要的。而现在肺炎疫苗研发的方向是基于 肺炎链球菌自身蛋白的疫苗，因其具有保守性并且非血清型依赖性、生产成本相对低廉和 免疫原性好将有可能成为新一代的肺炎链球菌疫苗。
[0004] 肺炎链球菌自身蛋白疫苗的研发已经有几十年的历史了，现在已经获得了许多可 喜的结果。肺炎球菌蛋白疫苗的候选抗原主要是与感染密切相关的肺炎链球菌重要的毒力 因子和表面蛋白。很多肺炎链球菌疫苗候选蛋白都已经进行了研究，例如肺炎链球菌表面 蛋白A(Pneumococcal surface protein A，PspA)、肺炎链球菌溶血素蛋白（Pneumolysin， Ply)、肺炎链球菌表面粘附素A(Pneumococcal surface adhesion A，PsaA)、肺炎链球菌胆 固醇结合蛋白A(Pneumococcal choline-binding protein A，PcpA)与肺炎链球菌组氨酸 三耳关蛋白D(Pneumococcal histidine triad protein D，PhtD)等。
[0005] 大多数病原体是通过粘膜层侵入机体，例如通过鼻或肺等。因此如果能在局部粘 膜免疫，将更有利于预防呼吸道病原体的感染。然而，实际应用的肺炎链球菌疫苗多是进行 皮下或肌肉等系统免疫途径，因此不能诱导局部粘膜免疫应答。与皮下或肌肉等系统免疫 相比，鼻腔粘膜免疫容易给药，但是可溶性抗原鼻腔给药后吸收差并且免疫反应弱。因此， 选择合适的粘膜免疫佐剂尤为重要。霍乱毒素和大肠杆菌肠毒素等细菌毒素有很强的粘膜 佐剂活性，能增强粘膜免疫抗原的免疫反应性。但是，细菌毒素存在安全性问题，有文献报 道霍乱毒素能够引起小鼠大脑的炎症反应。

【发明内容】

[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗。本发明研究发现，与 对照组(PBS)相比，肺炎链球菌融合蛋白疫苗鼻腔免疫动物后不仅能够诱导出高效价的血 清特异性IgG抗体，也能诱导出高效价的局部粘膜特异性IgA，并且对不同肺炎链球菌菌株 的鼻腔攻毒都有很好的保护性作用。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白为肺炎链球菌毒力蛋白基因和蛋白连接 器基因重组后的表达产物，肺炎链球菌毒力蛋白为Ply、PspA、PsaA、PcpASPhtD。
[0009] PspA是一种胆固醇结合蛋白，是肺炎链球菌关键的毒力因子，至今在所有的临床 分离到的肺炎链球菌菌株中都能检测到PspA的表达。PspA在肺炎链球菌与宿主相互作用中 起到关键作用，主要是通过影响补体C3固定在菌体表面而发挥作用的，PspA通过抑制补体 沉积到菌体表面来阻断补体受体调节的清除菌体的作用;PspA还可以结合乳铁蛋白，抑制 乳铁蛋白的杀菌活性。很多研究已经对PspA的免疫保护作用进行了评估，现在已经证实了 重组的PspA蛋白免疫后诱导的免疫应答可以保护各种动物攻毒模型，例如肺炎链球菌定 植、肺炎链球菌肺炎、菌血症和脑膜炎。PspA蛋白分子在所有肺炎链球菌中并不完全保守， 存在着结构变异性，分子量由67-100KD不等。PspA分子分为5个区域:信号肽区、a螺旋区、脯 氨酸富集区、胆碱结合区和C端17个氨基酸尾。基因和蛋白图谱研究结果显示，关键的交叉 保护性抗原表位位于a螺旋区中靠近脯氨酸富集区的大约100个氨基酸左右的序列，被称为 亚类决定区（亚类defining region，简称⑶R)。根据⑶R区的不同，PspA被分为3个家族(家 族1、家族2和家族3 )、6个亚类(亚类1、亚类2、亚类3、亚类4、亚类5和亚类6 )，6个亚类分别属 于3个家族;其中亚类1和亚类2属于家族1，亚类3、亚类4和亚类5属于家族2,亚类6属于家族 3。每个家族内亚类间CDR区基因序列相似度大于80%;各家族间CDR区基因序列间相似度大 于50%。在三个家族中，家族1与家族2流行率大于95%，而家族3很少出现。尽管PspA的结构 和抗原性具有多变性，但是针对PspA产生的抗体具有高度的交叉反应性与交叉保护性。 [0010] PsaA蛋白是一种保守的脂蛋白，并且在所有的临床分离株中均有表达，该蛋白参 与锰离子的转运和宿主细胞的粘附。PsaA突变后能够阻断体内Mn离子的转运，因此影响肺 炎链球菌各种功能，包括细菌的粘附功能和毒力。通过免疫基因工程方法表达的重组PsaA 蛋白或通过肺炎链球菌鼻咽部定植都能诱导出针对PsaA的特异性抗体，一些研究已经在各 种肺炎链球菌的攻毒模型中评价了 PsaA蛋白的免疫保护效能。
[0011] Ply是一种分子量为53kDa大小的分泌蛋白，属于胆固醇依赖型溶血素；在所有肺 炎链球菌临床分离株中都会有该蛋白的表达，也是肺炎链球菌的自溶素。Ply在肺炎链球菌 致病过程发挥重要作用，在体外对人细胞和组织也有直接的细胞毒性。Ply还可以在缺乏特 异性补体的情况下直接激活补体的经典途径，继而消耗血清中补体的调理活性。很多研究 都暗示Ply抗体可能对预防感染是有保护性的。由于天然的蛋白具有毒性，因此降低细胞毒 性和补体激活效应是该蛋白作为候选疫苗必须具备的。通过基因突变获得的脱毒的Ply已 经制备，并且仍然保持很好的免疫原性，本单位成功制备了脱毒的Ply减毒体命名为Plym2。
[0012] PcpA是肺炎链球菌的一种表面蛋白，90%以上的临床分离株中均有该蛋白的表 达。PcpA在肺炎链球菌的粘附中发挥重要作用，尤其是在与肺泡上皮细胞的粘附中。动物模 型中，免疫PcpA蛋白后对小鼠的肺炎和菌血症的攻毒模型都有很好的保护作用。
[0013] PhtD是肺炎链球菌的一种重要的毒力因子，该蛋白表达在菌体表面。虽然该蛋白 的功能现在仍未完全阐述，但是已经证实该蛋白可以抑制补体沉积到菌体表面并且可以结 合锌离子。免疫重组的PhtD蛋白对小鼠和灵长类的攻毒模型都有很好的保护作用。
[0014] 在本发明提供的一些实施例中，蛋白连接器(PA)为乳酸乳球菌细胞壁水解酶ACMA 细胞壁结合区域全序列或截短序列。
[0015] ACMA对乳酸乳球菌的肽聚糖结构有很强的结合能力。现在ACMA的肽聚糖结合区已 经很明确，通过基因重组的方法将抗原与PA融合表达，然后与BLP混合这样抗原就很容易结 合到BLP上。PA与BLP的结合是很稳定的，结合后不易分离。
[0016]作为优选，PA的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 不。
[0017]作为优选，Ply为Ply蛋白全序列或截短序列，或突变减毒序列；
[0018] 优选地，Ply为突变减毒序列Plym2，Plym2的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，其核 苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0019] PspA为PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中任何一个亚类的全序列或截短 序列，或者突变序列，或者PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中两个或两个以上亚类 的全部或部分序列的融合蛋白；
[0020] 作为优选，PspA2为PspA亚类2的a螺旋区，PspA亚类2的N端氨基酸序列为SEQ ID 从):9所示的序列，？8口42的核苷酸序列如3￡〇10从)：12所示。
[0021] 作为优选，PspA4为PspA亚类4的PspA蛋白序列，PspA亚类4的N端氨基酸序列如SEQ ID N0:15所示，PspA4的核苷酸序列如SEQ ID N0:18所示。
[0022]作为优选，PsaA为PsaA蛋白全序列或截短序列；
[0023] 优选地，PsaA的氨基酸序列如SEQ ID N0: 21所示，PsaA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 24所示。
[0024]作为优选，PcpA为PcpA蛋白全序列或截短序列；
[0025] 优选地，PcpA的氨基酸序列如SEQ ID N0: 27所示，PcpA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 30所示。
[0026]作为优选，PhtD为PhtD蛋白全序列或截短序列；
[0027] 优选地，PhtD的氨基酸序列如SEQ ID N0: 33所示，PhtD的核苷酸序列如SEQ ID NO: 36所示。
[0028]作为优选，肺炎链球菌毒力蛋白为Plym2，融合蛋白（Plym2_PA融合蛋白）的氨基酸 序列如SEQ ID N0:7所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0029]作为优选，PspA为PspA亚类2的a螺旋区，融合蛋白（PspA2_PA融合蛋白）的氨基酸 序列如SEQ ID N0:13所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示。
[0030] 作为优选，PspA为PspA亚类4,融合蛋白（PspA4-PA融合蛋白）的氨基酸序列如SEQ ID N0:19所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:20所示。
[0031 ]作为优选，PsaA为PsaA蛋白截短序列，融合蛋白（PsaA-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:25所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:26所示。
[0032]作为优选，PcpA为PcpA蛋白截短序列，融合蛋白（PcpA-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:31所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:32所示。
[0033]作为优选，PhtD为PhtD蛋白截短序列，融合蛋白（PhtD-PA融合蛋白）的氨基酸序列 如SEQ ID N0:37所示，其核苷酸序列如SEQ ID N0:38所示。
[0034] 本发明还提供了编码该融合蛋白的融合基因，融合基因由肺炎链球菌毒力蛋白基 因和蛋白连接器基因重组获得，肺炎链球菌毒力蛋白为Ply、PspA、PsaA、PcpASPhtD。
[0035] 作为优选，融合基因是经密码子优化设计的。
[0036] 优选地，融合基因是按照大肠杆菌(Escherichia coli)偏爱的密码子优化设计 的。
[0037]作为优选，Ply为Ply蛋白全序列或截短序列，或突变减毒序列Plym2。
[0038] 作为优选，PspA为PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中任何一个亚类的全序 列或截短序列，或者突变序列，或者PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中两个或两个 以上亚类的全部或部分序列的融合蛋白。
[0039]作为优选，PsaA为PsaA蛋白全序列或截短序列。
[0040]作为优选，PcpA为PcpA蛋白全序列或截短序列。
[00411作为优选，PhtD为PhtD蛋白全序列或截短序列。
[0042]作为优选，肺炎链球菌毒力蛋白为Plym2,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:8 所示。
[0043]作为优选，PspA为PspA亚类2,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0044] 作为优选，PspA为PspA亚类4,融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
[0045]作为优选，PsaA为PsaA蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所 不。
[0046] 作为优选，PcpA为PcpA蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 32所 不。
[0047]作为优选，PhtD为PhtD蛋白截短序列，融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所 不。
[0048] 本发明还提供了一种重组表达载体，重组表达载体为包含本发明提供的融合基因 的重组表达载体。
[0049] 作为优选，重组表达载体采用的表达载体为质粒。
[0050] 作为优选，重组表达载体采用的表达载体为pET20b质粒。
[0051 ]本发明还提供了一种该重组表达载体的细胞。
[0052]作为优选，细胞为原核细胞。
[0053]优选地，细胞为大肠杆菌。
[0054]更优选地，细胞为大肠杆菌BL21。
[0055] 本发明还提供了该融合蛋白的制备方法，包括：
[0056] 将本发明提供的融合基因插入表达载体，将所得的重组表达载体导入细胞，使融 合基因表达生成融合蛋白。
[0057] 作为优选，制备方法还包括分离纯化融合蛋白的步骤。
[0058] 作为优选，分离纯化采用的方法为亲和层析、离子交换层析、疏水层析和/或凝胶 过滤层析。
[0059] 本发明还提供了一种肺炎链球菌重组蛋白疫苗，包括本发明提供的融合蛋白和细 菌样颗粒(BLP)。
[0060] 细菌样颗粒(Bacterium-1 ike particles，缩写为BLP)是一种新型的粘膜佐剂，它 将佐剂的颗粒性质与免疫刺激性质完美的融合为一体。BLP可以来源于灭活的乳酸乳球菌。 乳酸乳球菌是一种安全的细菌，它被广泛应用在益生菌饮料和奶产品的生产。BLP是通过热 酸处理乳酸乳球菌得到，为无生命活性的球型的颗粒，主要成分为乳酸乳球菌肽聚糖壳，因 其大小与形态与细菌相似，故得名细菌样颗粒即BLP3LP颗粒作为疫苗抗原成分的载体，可 以有效的结合抗原并将抗原展示到其表面。BLP本身的肽聚糖壳通过与Toll样受体的作用 而激活固有性免疫系统发挥佐剂的功能。
[0061] 作为优选，本发明提供的融合蛋白为Plym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、 PcpA-PA或PhtD-PA中的一种或几种。
[0062] 作为优选，肺炎链球菌重组蛋白疫苗为？171112-?厶-81^、？8口厶2-?厶-81^、？8口厶4-?八-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 或 PhtD-PA-BLP 中的一种或几种。
[0063] 优选地，肺炎链球菌重组蛋白疫苗为PspA2-PA-BLP和/或PspA4-PA-BLP。
[0064]作为优选，BLP为通过培养革兰阳性菌、热酸处理培养的菌体得到；
[0065]作为优选，革兰阳性菌为乳酸乳球菌。
[0066]作为优选，热酸处理的方法为终浓度为10%的三氯乙酸72°C处理2小时。
[0067]本发明还提供了一种该肺炎链球菌重组蛋白疫苗的制备方法，包括：
[0068]将融合蛋白与细菌样颗粒混合，在4~30 °C条件下结合20~60分钟，通过离心或超 滤的方法去除未结合的融合蛋白，得到肺炎链球菌重组蛋白疫苗。
[0069] 在本发明提供的一些实施例中，肺炎链球菌重组蛋白疫苗的制备方法为:将融合 蛋白与BLP混合，室温振荡结合30分钟，然后离心去除未结合的融合蛋白，洗涤5次，PBS重 悬，得到肺炎链球菌重组蛋白疫苗。
[0070] 优选地，融合蛋白为纯化的融合蛋白。
[0071] 本发明还提供了一种肺炎链球菌重组蛋白疫苗组合物，包括本发明提供的肺炎链 球菌重组蛋白疫苗。
[0072] 本发明还提供了本发明肺炎链球菌重组蛋白疫苗或其组合物在制备预防肺炎链 球菌感染的疫苗中的应用。
[0073] 本发明还提供了一种细菌样颗粒的制备方法，该细菌样颗粒为通过培养革兰阳性 菌，然后通过热酸处理培养的菌体得到；
[0074] 优选地，革兰阳性菌为乳酸乳球菌，热酸处理为终浓度为10%的三氯乙酸72°C处 理2个小时。
[0075]本发明提供了一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗。该融合蛋白为肺炎链球菌毒力 蛋白基因和蛋白连接器基因重组后的表达产物，肺炎链球菌毒力蛋白为Ply、PsPA、PsaA、 PcpA或PhtD。本发明具有如下有益效果：
[0076]本发明研究发现，与对照组(PBS)相比，本发明肺炎链球菌重组蛋白疫苗鼻腔免疫 动物后不仅能够诱导出高效价的血清特异性IgG抗体，也能诱导出高效价的局部粘膜特异 性IgA，并且对不同肺炎链球菌菌株的鼻腔攻毒都有很好的保护性作用；
[0077] 与对照组（PBS)相比，PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合免疫组对肺炎链球菌 PspA分型家族1和家族2的攻毒菌株都有很好的保护作用。
【附图说明】
[0078] 图 1 示pET20b-Plym2-PA的Nde I/BamH I/Xho I酶切鉴定结果，其中，泳道 1 示lkb DNA Ladder，泳道2-3均示pET20b-Plym2-PA质粒Nde I/BamH I/Xho 頂每切结果；
[0079] 图2示pET20b-PspA2-PA的Nde I/BamH I酶切鉴定结果，其中，泳道l:lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PspA2-PA的Nde I/BamH 頂每切结果；
[0080] 图3示pET20b-PspA4-PA的Nde I/BamH I酶切电泳鉴定结果，其中，泳道l:lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PspA4-PA的Nde I/BamH 頂每切结果；
[0081 ] 图4示pET20b-PsaA-PA的Nde I/BamH I酶切电泳鉴定结果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PsaA-PA的Nde I/BamH 頂每切结果；
[0082] 图5示pET20b-PcpA-PA的Nde I/BamH I酶切电泳鉴定结果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PcpA-PA的Nde I/BamH 頂每切结果；
[0083] 图6示pET20b-PhtD-PA的Nde I/BamH I酶切电泳鉴定结果，其中，泳道1示lkb DNA Ladder，泳道2:pET20b-PhtD-PA的Nde I/BamH 頂每切结果；
[0084] 图 7示SDS-PAGE电泳鉴定Plym2-PA-BLP，泳道l:Marker，泳道2:BLP，泳道3-4: Plym2-PA-BLP；
[0085] 图 8示 SDS-PAGE 电泳鉴定 PspA2-PA-BLP，泳道 1: Marker，泳道 2-3: PspA2-PA-BLP， 泳道4:BLP;
[0086] 图9示SDS-PAGE电泳鉴定PspA4-PA-BLP，泳道 1:Marker，泳道2 : BLP，泳道3-4 : PspA4_PA_BLP;
[0087] 图 10示SDS-PAGE电泳鉴定PsaA-PA-BLP，泳道 1 :Marker，泳道2 :BLP，泳道3-4 : PsaA-PA-BLP;
[0088] 图 11示SDS-PAGE电泳鉴定 PcpA-PA-BLP，泳道1: Marker，泳道 2: BLP，泳道 3: PcpA-PA-BLP；
[0089] 图 12示 SDS-PAGE 电泳鉴定 PthD-PA-BLP，泳道 1: Marker，泳道2: BLP，泳道 3: PthD-PA-BLP；
[0090]图13示Plym2-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中13-1示血清特异性IgG，13-2示 局部粘I吴特异性IgA;
[0091] 图14示PspA2-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中14-1示血清特异性IgG，14-2示 局部粘I吴特异性IgA;
[0092] 图15示PspA4-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中15-1示血清特异性IgG，15-2示 局部粘I吴特异性IgA;
[0093] 图16示PsaA-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中16-1示血清特异性IgG，16-2示 局部粘I吴特异性IgA;
[0094]图17示PcpA-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中17-1示血清特异性IgG，17-2示 局部粘I吴特异性IgA;
[0095] 图18示PhtD-PA-BLP疫苗免疫原性检测结果，其中18-1示血清特异性IgG，18-2示 局部粘膜特异性IgA;
[0096] 图19、图 20示P1ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP与PhtD-PA-BLP的免疫保护作用；其中图19示使用PspA家族1的肺炎链球菌进行攻毒 后的免疫保护作用，图20示使用PspA家族2的肺炎链球菌进行攻毒后的免疫保护作用。
【具体实施方式】
[0097] 本发明公开了一种肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实 施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0098] 本发明提供的肺炎链球菌融合蛋白及其疫苗中所用生物材料、试剂等均可由市场 购得。
[0099] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0100] 实施例1:编码目标蛋白的核酸序列的获得
[0101] l.Plym2-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0102] PA为乳酸乳球菌细胞壁水解酶ACMA(GenBank:U17696.1)的219-437位氨基酸序 列，如SEQ ID N0:1所示。选择大肠杆菌偏爱的密码子对编码PA氨基酸序列的核苷酸序列进 行优化，在核酸合成时5'端引入了BamH I酶切位点与接头序列，3'端引入了终止密码子与 Xho I酶切位点，从而获得了编码PA蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID N0:2所示。PA的编码核苷 酸序列委托上海生工生物工程有限公司进行基因合成，合成的PA编码核苷酸序列插入到 pGH质粒中。对其进行测序，验证无误。
[0103] Plym2为Ply (肺炎链球菌溶血素）的突变体，是将Ply序列(GenBank: NC_003098 ? 1) 中的第428位半胱氨酸突变为甘氨酸;第433位色氨酸突变为苯丙氨酸。该位点是决定Ply溶 血活性的重要位点；突变后的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本实验室已经成功设计和构 建了Plym2的表达载体pRSETB-Plym2,因此本申请中将以该质粒为模板通过PCR技术获得 ?1丫1112蛋白的核酸序列 ：通过?〇?技术，以载体口1?￡了8-?171112为模板，以如5￡0 10^):4所示 的序列为5'端引物，以如SEQ ID N0:5所示的序列为3'端引物，获得如SEQ ID N0:6所示的 核苷酸序列。反应体系和反应条件如下：
[0104] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0105] PCR 反应条件为：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0106]将测序正确的PCR扩增的Plym2核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。 连接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C过夜。次日转化到E.coli Top 10(购于天根生化科技有限公司），涂板37°C培养过夜。选取 单克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正 确的质粒用于酶切操作。
[0107] Plym2-PA蛋白序列为上述Plym2与PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:7所示； 卩17!112^^编码核苷酸序列如3￡〇10从):8所示。
[0108] 2. PspA2-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0109] PA氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得同前所述。
[0110] PspA2 为肺炎链球菌 RX1菌株 PspA(家族1亚类 2)(GenBank:M74122.1)的32-319 位 氨基酸序列，如3￡〇10^):9所示;？叩42核酸序列是以本实验室构建的表达载体口￡12013-PsaA-PspA质粒为模板通过PCR技术获得的。为了蛋白纯化的需要，本申请通过PCR技术在 PspA2序列的N端引入了 6Hi s组氨酸标签;为了表达载体构建的需要，通过PCR技术在PspA2 序列两端引入Nde I和BamH I两个酶切位点。
[0111] 通过?〇?技术，以载体口￡了2013-?8&4-?8口4为模板，以如3￡0 10勵:10所示的序列为 5'端引物，以如SEQ ID N0:11所示的序列为3'端引物，获得如SEQ ID N0:12所示的PspA2核 苷酸序列。
[0112] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0113] PCR 反应条件为：94°〇5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0114] 将测序正确的PCR扩增的PspA2核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。 连接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C过夜。次日转化到E.coli Top 10(购于天根生化科技有限公司），涂板37°C培养过夜。选取 单克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正 确的质粒用于酶切操作。
[0115] ?8口厶2-?厶蛋白序列为上述？8口厶2与卩厶蛋白序列的融合，如3￡〇10觀：13所示 ； ?8口六2^^编码核苷酸序列如3￡〇10从)：14所示。
[0116] 3. PspA4-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0117] PA氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得同前所述。
[0118] PspA4序列为肺炎链球菌EF5668菌株的PspA (家族2亚类4) (GenBank: U89711.1)的 32-450位氨基酸序列，如SEQ ID N0:15所示。PspA4核酸序列是以本实验室构建的表达载体 pET20b-PspA4质粒为模板通过PCR技术获得的。为了蛋白纯化的需要，本申请通过PCR技术 在PspA4序列的N端引入了6Hi s组氨酸标签；为了表达载体构建的需要，通过PCR技术在 PspA4序列两端引入Nde I和BamH I两个酶切位点。
[0119] 通过?〇?技术，以载体口6了2013-?8口44为模板，以如3￡0 10勵:16所示的序列为5'端 引物，以如SEQ ID N0:17所示的序列为3'端引物，获得如SEQ ID N0:18所示的核苷酸序列。
[0120] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0121] PCR 反应条件为：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0122] 将测序正确的PCR扩增的PspA4核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。 连接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C过夜。次日转化到E.coli Top 10(购于天根生化科技有限公司），涂板37°C培养过夜。选取 单克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正 确的质粒用于酶切操作。
[0123] ?叩厶4-?厶蛋白序列为上述？8口厶4与卩厶蛋白序列的融合，如3￡〇10觀：19所示； ?8口六4^^编码核苷酸序列如3￡〇10从):20所示。
[0124] 4. PsaA-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0125] PA氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得同前所述。
[0126] PsaA序列为肺炎链球菌D39菌株的PsaA(GenBank: P0A4G2.1)的20-309位氨基酸序 列，如SEQ ID ^):21所示。本实验室已经成功设计和构建了表达载体?￡12013-?8&4-?8口八， PsaA核酸序列是以该质粒为模板通过PCR技术获得的。为了蛋白纯化的需要，我们通过PCR 技术在PsaA序列的N端引入了6Hi s组氨酸标签;为了表达载体构建的需要，通过PCR技术在 PspA4序列两端引入Nde I和BamH I两个酶切位点。通过PCR技术，以载体pET20b-PsaA-PspA 为模板，以如SEQ ID N0:22所示的序列为5'端引物，以如SEQ ID N0:23所示的序列为3'端 引物，获得如SEQ ID N0:24所示的PsaA核苷酸序列。
[0127] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0128] PCR 反应条件为：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0129] 将测序正确的PCR扩增的PsaA核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。连 接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C 过夜。次日转化到E. co 1 i Top 10 (购于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培养过夜。选取单 克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正确 的质粒用于酶切操作。
[0130] PsaA-PA蛋白序列为上述PsaA与PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0: 25所示;PsaA-PA编码核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。
[0131 ] 5. PcpA-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0132] PA氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得同前所述。
[0133] PcpA 序列为肺炎链球菌 TIGR4 菌株的 PcpA(GenBank:NC_003028.3)的 21-463 位氨 基酸序列，如SEQ ID ^):27所示。本实验室已经成功设计和构建了表达载体?￡12013-?〇口八， PcpA核酸序列是以该质粒为模板通过PCR技术获得的。为了蛋白纯化的需要，我们通过PCR 技术在PcpA序列的N端引入了6Hi s组氨酸标签;为了表达载体构建的需要，通过PCR技术在 PcpA序列两端引入Nde I和BamH I两个酶切位点。
[0134] 通过PCR技术，以载体pET20b-PcpA为模板，以如SEQ ID N0:28所示的序列为5'端 引物，以如SEQ ID N0:29所示的序列为3'端引物，获得如SEQ ID N0:30所示的核苷酸序列。
[0135] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0136] PCR 反应条件为：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0137] 将测序正确的PCR扩增的PcpA核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。连 接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C 过夜。次日转化到E. co 1 i Top 10 (购于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培养过夜。选取单 克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正确 的质粒用于酶切操作。
[0138] PcpA-PA蛋白序列为上述PcpA与PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:31所示;PsaA- PA编码核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
[0139] 6. PhtD-PA融合蛋白氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得
[0140] PA氨基酸序列的选取，编码核苷酸序列的获得同前所述。
[0141] 选取肺炎链球菌蛋白PhtD(GenBank:AF318955.1)的447-656位氨基酸序列，如SEQ ID N0:33所示。本实验室已经成功设计和构建了表达载体pET20b-PhtD，PhtD核酸序列是以 该质粒为模板通过PCR技术获得的。为了蛋白纯化的需要，我们通过PCR技术在PhtD序列的N 端引入了6His组氨酸标签；为了表达载体构建的需要，通过PCR技术在PhtD序列两端引入 Nde I和BamH I两个酶切位点。
[0142] 通过PCR技术，以载体pET20b-PhtD为模板，以如SEQ ID N0:34所示的序列为5'端 引物，以如SEQ ID N0:35所示的序列为3'端引物，获得如SEQ ID N0:36所示的核苷酸序列。
[0143] PCR反应体系为：5 '端引物lyL; 3 '端引物lyL;模板lyL; Taq酶0 ? 5yL; 10 X PCR缓冲 液 5此；dNTP (1 Ommo 1) lyL; MgSCU (50mmo 1) 1 ? fSuL;水39uL 〇
[0144] PCR 反应条件为：941€5111111;941€3〇8,571€3〇8,72 1€9〇8(共30个循环）；72°(：1〇111111。
[0145] 将测序正确的PCR扩增的PhtD核苷酸序列连接到T-easy载体(购于PROMEGA)中。连 接体系:T-easy lyL; PCR产物0 ? 5yL; T4连接酶0 ? 5yL; 10 X T4缓冲液1此;水7yL。条件为：16 °C 过夜。次日转化到E. co 1 i Top 10 (购于天根生化科技有限公司），涂板37 °C培养过夜。选取单 克隆接种到5ml LB培养基中，培养过夜。然后用质粒提取试剂盒提取质粒，测序。测序正确 的质粒用于酶切操作。
[0146] PhtD-PA蛋白序列为上述PhtD与PA蛋白序列的融合，如SEQ ID N0:37所示;PhtD-PA编码核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
[0147] 实施例2:融合蛋白的表达与疫苗的制备
[0148] 1、表达载体的构建
[0149] 将带有测序正确的Plym2编码核酸（SEQ ID N0:6)的质粒以Nde I和BamH I双酶 切，回收Plym2核酸片段;将将带有测序正确的PA编码核酸（SEQ ID N0:2)的质粒以BamH I 和Xho I双酶切，回收PA核酸片段;将表达载体PET20b(购于Novagen公司）以Nde I和Xho I 双酶切，回收载体片段。将经过Nde I/BamH頂每切得到的Plym2片段，经过BamH I/Xho I酶 切的PA片段以及经过Nde I/Xho頂每切后具有黏性末端的pET20b空载体共连接，然后转化 E.coli Topl0(购于天根生化科技有限公司），加入含有50iig/ml氨节青霉素的LB培养基平 板中培养过夜，次日挑克隆到加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，第二天 提取质粒。用Nde I、BamH I和Xho I酶切后，将酶切鉴定结果正确的克隆测序，挑选与目的 序列一致的克隆，从而获得表达质粒pET20b-Plym2-PA。用Nde I/BamH I/Xho頂每切质粒进 行验证，片段大小正确。酶切结果分别如图1所示，对酶切鉴定正确的质粒进行测序，选取序 列正确的表达质粒。
[0150] 将上述测序正确的pET20b-Plym2-PA质粒以Nde I和BamH I双酶切，回收pET20b-PA核酸片段;将带有测序正确的PspA2编码核酸(SEQ ID NO: 12)的质粒以Nde I和BamH I双 酶切，回收PspA2核酸片段;将带有测序正确的PspA4编码核酸(SEQ ID NO: 18)的质粒以Nde I和BamH I双酶切，回收PspA4核酸片段;将带有测序正确的PsaA编码核酸（SEQ ID N0:24) 的质粒以Nde I和BamH I双酶切，回收PsaA核酸片段;将带有测序正确的PcpA编码核酸(SEQ ID N0:30)的质粒以Nde I和BamH I双酶切，回收PcpA核酸片段;将带有测序正确的PhtD编 码核酸（3￡〇10如:36)的质粒以制61和8&111111双酶切，回收?1^0核酸片段。分别将经过 Nde I/BamH I酶切得到的PspA2片段、PspA4片段、PsaA片段、PcpA片段和PhtD片段，与经过 Nde I/BamH I酶切的pET20b-PA核酸片段连接，然后转化E.coli ToplO(购于天根生化科技 有限公司），加入含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板中培养过夜，次日挑克隆到加入 含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，第二天提取质粒。用Nde I和BamH頂每切 后，将酶切鉴定结果正确的克隆测序，挑选与目的序列一致的克隆，从而获得表达质粒 PA。用Nde I/BamH I酶切质粒进行验证，片段大小正确。酶切结果分别如图2-6所示，对酶切 鉴定正确的质粒进行测序，选取序列正确的表达质粒。
[0151] 2?在宿主菌中表达目的蛋白PIym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、PcpA-PA和 PhtD-PA融合蛋白：
[0152] 分别将测序正确的重组表达质粒口￡12013-?171112-?44￡12013-?8口42-?44￡12013-PspA4-PA、pET20b-PsaA-PA、pET20b-PcpA-PA 与 pET20b-PhtD-PA 转化大肠杆菌 BL21 (DE3)感 受态细胞(购于TransGen Biotech)。用含50iig/ml氨节青霉素的LB琼脂平板筛选。挑取单菌 落接种于含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB培养基中，37°C振荡培养过夜。次日取50yl过夜培 养物接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中。37°C振荡培养约3小时，至OD600~0.4-0.6时，添加终浓度ImM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG)，（对照组为不添加 IPTG)，37°C诱导表 达5-6小时，4°C下12000rpm离心5分钟收集细菌。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及 蛋白质免疫印迹(western blotting)鉴定目的蛋白的表达。
[0153] 3.培养和扩增表达宿主:将蛋白表达量高的克隆，扩增培养，将过夜培养物按1:50 的比例接种于新鲜的含50μg/ml氨苄青霉素的500ml LB培养液中，37°C振荡培养约3小时， 至OD600~0.4-0.6时，添加终浓度ImM的IPTG，（对照组为不添加 IPTG)，37°C诱导表达5-6小 时，取大量表达的细菌培养液，4°C6000rpm离心30分钟，收集细胞沉淀，弃上清。
[0154] 4.BLP的制备:将乳酸乳球菌冻存菌种融化后加入到100mL含葡萄糖的M17液体培 养基中，30 °C静止培养过夜。次日，按照1:50 (v: v)的比例转接到1L Ml7液体培养基中，30 °C 静止培养过夜。次日，离心收集菌体。将上述乳酸乳球菌菌体用注射用水洗涤三次，然后重 悬，加入终浓度为10%的三氯乙酸(TCA);加热至72°C，孵育2h降解菌体表面蛋白和细胞内 核酸与蛋白，然后离心去上清，将沉淀用PBS重悬洗涤;反复洗涤三次去除TCA和降解的核酸 与蛋白，再次重悬到PBS中，即得到了BLP。
[0155] 5 ? BLP 技术疫苗P1 ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 与 PhtD-PA-BLP 的制备：
[0156] 按照上述确定的表达条件大量表达Plym2-PA、PspA2-PA、PspA4-PA、PsaA-PA、 PcpA-PA与PhtD-PA融合蛋白，离心收集表达的菌体，SDS-PAGE确定各目的蛋白的表达情况。 将表达菌体超声破碎:整个超声破碎过程中在冰浴中进行，超声功率设定为37 %，超声时间 为20min。经过超声破碎之后，将破碎的菌体分装到离心筒中进行离心，条件为12000rpm/ min，离心30min。结束后，用吸管取出上清液避免浑浊，然后将上清液用0.22mi滤膜进行过 滤去除颗粒杂质。将超声后的表达 PhtD-PA融合蛋白的上清分别加入到制备的BLP溶液中，在室温条件下振荡结合30min。 13000rpm离心10min，将沉淀用PBS重悬洗涤，重复洗涤5次。将经过洗涤的Plym2-PA-BLP、 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 与 PhtD-PA-BLP 重悬于 PBS 溶液 中。
[0157] 用BLP定量法进行定量，SDS-PAGE确定结合情况。Plym2-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电 泳结果如图7,与BLP对照相比，Plym2-PA-BLP在80kD处有一条明显条带，其大小与Plym2-PA 蛋白相符，表明Plym2-PA融合蛋白结合到了 BLP上；
[0158] PspA2-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电泳结果如图8,与BLP对照相比，PspA2-PA-BLP在 70kD处有一条明显条带，其大小与PspA2-PA蛋白相符，表明PspA2-PA融合蛋白结合到了 BLP 上；
[0159] PspA4-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电泳结果如图9,与BLP对照相比，PspA4-PA-BLP在 95kD处有一条明显条带，其大小与PspA4-PA蛋白相符，表明PspA4-PA融合蛋白结合到了 BLP 上；
[0160] PsaA-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电泳结果如图10,与BLP对照相比，PsaA-PA-BLP在 65kD处有一条明显条带，其大小与PsaA-PA蛋白相符，表明PsaA-PA融合蛋白结合到了 BLP 上；
[0161] PcpA-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电泳结果如图11，与BLP对照相比，PcpA-PA-BLP在 90kD处有一条明显条带，其大小与PcpA-PA蛋白相符，表明PcpA-PA融合蛋白结合到了 BLP 上；
[0162] PhtD-PA-BLP疫苗的SDS-PAGE电泳结果如图12,与BLP对照相比，PhtD-PA-BLP在 55kD处有一条明显条带，其大小与PhtD-PA蛋白相符，表明PhtD-PA融合蛋白结合到了 BLP 上。
[0163] 结论:通过该实施例的实验，可以获得大量BLP技术疫苗?171112^^-81^、？8口42^^-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP与PhtD-PA-BLP。
[0164] 实施例3:疫苗的免疫原性检测
[0165] 将BALB/c小鼠（16-18g)随机分组，每组6只。分别将溶于PBS中的Plym2-PA-BLP、 PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP 与 PhtD-PA-BLP 进行小鼠鼻腔免 疫，按照BLP的量计算0.3mg/只小鼠，进行3次鼻腔免疫；阴性对照为PBS加 BLP，按照BLP的量 计算0.3mg/只小鼠，也进行鼻腔粘膜免疫3次;每次免疫间隔14天。皮下免疫对照组为本实 验室纯化的？1}〇112、？8口厶2、？8口厶4、？83厶、？〇口厶或？1^0蛋白，20邱蛋白每只小鼠与100邱八1 (〇H) 3佐剂混匀，用以上混合剂分别后背皮下三点免疫小鼠，共免疫3次，每次间隔14天。在 最后一次免疫14天后，对小鼠取血和支气管-肺泡灌洗液(BALF)，分别检测血清中特异性 IgG及BALF中特异性IgA的效价。用酶联免疫吸附试验ELISA检测血清中IgG与BALF中IgA的 抗体水平。
[0166] 血清IgG抗体水平检测方法简述如下：首先分别用本实验室纯化的Plym2、PspA2、 PspA4、PsaA、PcpA或PhtD ELISA检测用抗原包被ELISA反应板，4°C孵育过夜；次日用3 %牛 血清白蛋白（BSA)封闭ELISA反应板孵育2小时;然后加入10倍系列稀释的免疫血清，37°C孵 育45分钟；用PBS-T(PH7 ? 4，0 ? 5%Tween20)洗涤ELISA板后，加入lOOyLl: 10000稀释的辣根 过氧化物酶(HRP)-标记的山羊抗小鼠二抗(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），37°C孵 育45分钟；洗板后，加入四甲基联苯胺(TMB，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）显 色15分钟；显色结束后加入2mol H2S〇4终止反应，用酶标检测仪(BI0-RAD公司）在450nm波长 下检测吸光度。抗体效价为血清抗体滴度的负对数。
[0167] BALF中IgA的抗体水平检测方法简述如下：首先分别用本实验室纯化的Plym2、 ?8口六2、？8?44、？8&4、？〇?4或?1^0蛋白抗原包被￡1^4反应板，4°(：孵育过夜；次日用3%牛血 清白蛋白（BSA)封闭ELISA反应板孵育2小时;然后加入系列稀释的BALF洗液，37°C孵育45分 钟；用PBS-T(PH7.4，0.5 % Tween20)洗涤ELISA板后，加入lOOyLl: 1000稀释的辣根过氧化物 酶(HRP)-标记的山羊抗小鼠 IgA抗体二抗(天津三箭），37°C孵育45分钟；洗板后，加入四甲 基联苯胺（TMB，购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）显色15分钟；显色结束后加入 2mol H2S〇4终止反应，用酶标检测仪(BI0-RAD公司）在450nm波长下检测吸光度。抗体效价为 血清抗体滴度的负对数。
[0168] BLP技术疫苗P1 ym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、PcpA-PA-BLP与PhtD-PA-BLP血清IgG水平与BALF粘膜IgA水平检测结果如图13~图18所示。
[0169] 结论：如图13~图18所示，与对照组(BLP)相比，将蛋白结合到BLP表面制备成BLP 技术疫苗时，即 BLP 技术疫苗 Plym2-PA-BLP、PspA2-PA-BLP、PspA4-PA-BLP、PsaA-PA-BLP、 PcpA-PA-BLP与PhtD-PA-BLP疫苗，鼻腔粘膜免疫后不仅可以诱导机体产生高效价的血清特 异性IgG，同时也能诱导机体产生高效价的局部粘膜特异性IgA。蛋白皮下免疫后可以诱导 机体产生高效价的血清特异性IgG，但是不能诱导机体产生局部粘膜特异性IgA。
[0170] 实施例4:疫苗的免疫保护作用
[0171 ] 1.使用PspA家族1的肺炎链球菌进行攻毒
[0172] 分别将制备的 PI ym2-PA-BLP 单独、PsaA-PA-BLP 单独、PcpA-PA-BLP 单独、PhtD-PA-BLP 单独、 PspA2-PA-BLP 单独、 PspA4-PA-BLP 单独或 PspA2-PA-BLP 与 PspA4-PA-BLP 联合进行 小鼠鼻腔免疫。作为阴性对照，将等体积的PBS与BLP混合均匀进行鼻腔免疫。BLP技术疫苗 无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量按BLP量计算均为0.3mg每只小鼠。取6~8周龄 BALB/c雌性小鼠，将其随机分组，每组10只。用以上疫苗分别进行小鼠鼻腔免疫，共免疫3 次，每次间隔14天。作为阳性对照，选用市售23价多糖肺炎疫苗，免疫方式为后背皮下，按疫 苗说明只免疫一次与蛋白组第一次免疫(简称"一免"）同时进行，免疫剂量为人免疫剂量的 1/5，100此每只小鼠。末次免疫后第14天，用肺炎链球菌ATCC10813菌株(PspA分型家族1亚 类2)进行攻毒(菌株均购于美国菌种保藏中心）。攻毒方式为鼻腔攻毒，攻毒剂量为致死剂 量(10 5CFU/只小鼠）。攻毒后14天为生存观察期。如图19所示，结果如下：
[0173] (1)与对照组(BLP)相比，使用BLP技术疫苗Plym2-PA_BLP单独、PsaA-PA-BLP单独、 PcpA-PA-BLP 单独、PhtD-PA-BLP 单独、PspA2-PA-BLP 单独、PspA4-PA-BLP 单独或 PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合以及23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
[0174] (2奸叩42-?4-81^与？叩44-?4-81^无论是单独免疫还是联合免疫对攻毒小鼠的保 护作用都可以达到100%的保护率，优于其他几种BLP技术疫苗和23价肺炎多糖疫苗（23-valent PPV);虽然PspA4蛋白属于家族2的蛋白，但是PspA4-PA-BLP疫苗免疫后对PspA家族 1菌株的攻毒小鼠也可以达到很高的保护率，说明PspA蛋白免疫后具有交叉保护性。
[0175] (3)虽然23价肺炎多糖疫苗组免疫后对攻毒小鼠有一定的保护性，但是这种保护 作用远不如PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP疫苗组对攻毒小鼠的保护率。
[0176] 2.使用PspA家族2的肺炎链球菌进行攻毒
[0177] 分别将制备的 PI ym2-PA-BLP 单独、PsaA-PA-BLP 单独、PcpA-PA-BLP 单独、PhtD-PA- BLP 单独、PspA2-PA-BLP 单独、PspA4-PA-BLP 单独或 PspA2-PA-BLP 与 PspA4-PA-BLP 联合进行 小鼠鼻腔免疫。作为阴性对照，将等体积的PBS与BLP混合均匀进行鼻腔免疫。BLP技术疫苗 无论是单独免疫还是联合免疫，使用剂量按BLP量计算均为0.3mg每只小鼠。取6~8周龄 BALB/c雌性小鼠，将其随机分组，每组10只。用以上疫苗分别进行小鼠鼻腔免疫，共免疫3 次，每次间隔14天。作为阳性对照，选用市售23价多糖肺炎疫苗，免疫方式为后背皮下，按疫 苗说明只免疫一次与蛋白组第一次免疫(简称"一免"）同时进行，免疫剂量为人免疫剂量的 1/5，100此每只小鼠。末次免疫后第14天，用肺炎链球菌ATCC6303菌株(PspA分型家族2亚类 5)进行攻毒(菌株均购于美国菌种保藏中心）。攻毒方式为鼻腔攻毒，攻毒剂量均为致死剂 量(2.2X106CFU/只小鼠）。攻毒后14天为生存观察期。如图20所示，结果如下：
[0178] (1)与对照组(BLP)相比，使用BLP技术疫苗Plym2-PA_BLP单独、PsaA-PA-BLP单独、 PcpA-PA-BLP 单独、PhtD-PA-BLP 单独、PspA2-PA-BLP 单独、PspA4-PA-BLP 单独或 PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合以及23价多糖肺炎疫苗进行免疫的小鼠的存活率都有所提高。
[0179] (2 )PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP无论是单独免疫还是联合免疫对攻毒小鼠都有 很好的保护作用；虽然PspA2蛋白属于家族1的蛋白，但是PspA2-PA-BLP疫苗免疫后对PspA 家族2菌株的攻毒小鼠也可以达到很高的保护率，说明PspA蛋白免疫后具有交叉保护性。 [0180] (3)虽然23价肺炎多糖疫苗组免疫后对攻毒小鼠有一定的保护性，但是这种保护 作用远不如PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合疫苗组对攻毒小鼠的保护率。
[0181] 结论：
[0182] 本实施例的实验说明，与对照组相比，Plym2-PA_BLP单独、PsaA-PA-BLP单独、 PcpA-PA-BLP 单独、PhtD-PA-BLP 单独、PspA2-PA-BLP 单独、PspA4-PA-BLP 单独或 PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合免疫对两株肺炎链球菌的攻毒小鼠都用一定的保护作用。PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP无论是单独免疫还是联合免疫都有很好的保护作用，联合免疫后对 不同PspA分型的肺炎链球菌菌株的攻毒小鼠都可以达到100%保护。因此，本发明的BLP技 术疫苗可以用作鼻腔免疫的免疫原，用作疫苗。
[0183] PspA2-PA-BLP与PspA4-PA-BLP联合免疫对PspA分型家族1与家族2的攻毒菌株均 具有很好的保护作用。本发明的几种BLP疫苗可以相互组合作为联合疫苗或与其他肺炎链 球菌蛋白联合使用，通过相互组合或与其他蛋白的联合达到更优的保护效果。
[0184] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为肺炎链球菌毒力蛋白基因和蛋白连接 器基因重组后的表达产物，所述肺炎链球菌毒力蛋白为Ply、PspA、PsaA、P CpASPhtD。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白连接器为乳酸乳球菌细胞壁 水解酶ACMA细胞壁结合区域全序列或截短序列。3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Ply为Ply蛋白全序列或截短序 列，或突变减毒序列； 所述PspA为PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中任何一个亚类的全序列或截短 序列，或者突变序列，或者PspA亚类1、亚类2、亚类3、亚类4或亚类5中两个或两个以上亚类 的全部或部分序列的融合蛋白； 所述PsaA为PsaA蛋白全序列或截短序列； 所述PcpA为PcpA蛋白全序列或截短序列； 所述PhtD为PhtD蛋白全序列或截短序列。4. 根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述PspA为PspA亚类2的α螺旋区，所 述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:13所示;所述PspA为PspA亚类4,所述融合蛋白的氨 基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。5. -种编码权利要求1至4中任一项所述融合蛋白的融合基因。6. -种包含权利要求5所述融合基因的重组表达载体。7. 根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为包含权利要 求5所述融合基因的质粒;更优选地，所述重组表达载体为包含权利要求5所述融合基因的 pET20b 质粒。8. -种包含权利要求6或7所述的重组表达载体的细胞，所述细胞为原核细胞;优选地， 所述细胞为大肠杆菌;最优选地，所述细胞为大肠杆菌BL21。9. 一种权利要求1至4中任一项所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括： 将权利要求5所述的融合基因插入表达载体，将所得的重组表达载体导入细胞，使所述 融合基因表达生成所述融合蛋白。10. -种肺炎链球菌重组蛋白疫苗，其特征在于，包括权利要求1至4中任一项所述的融 合蛋白和细菌样颗粒。11. 一种权利要求10所述肺炎链球菌重组蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括： 将融合蛋白与细菌样颗粒混合，在4~30 °C条件下结合20~60分钟，通过离心或超滤的 方法去除未结合的融合蛋白，得到肺炎链球菌重组蛋白疫苗。12. -种肺炎链球菌重组蛋白疫苗组合物，其特征在于，包括权利要求10所述肺炎链球 菌重组蛋白疫苗。13. 权利要求10所述肺炎链球菌重组蛋白疫苗或权利要求12所述的组合物在制备预防 肺炎链球菌感染的疫苗中的应用。14. 一种细菌样颗粒的制备方法，其特征在于，所述细菌样颗粒为通过培养革兰阳性 菌，然后通过热酸处理培养的菌体得到;优选地，所述革兰阳性菌为乳酸乳球菌，热酸处理 为终浓度为10%的三氯乙酸72°C处理2个小时。
【文档编号】A61K39/09GK105968213SQ201610416667
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】孔维, 吴永革, 卢井才, 王丹丹, 董运亮, 侯宏嘉, 谷铁军, 姜春来
【申请人】长春百克生物科技股份公司, 吉林大学