一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
【专利摘要】一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，它涉及一种建立干细胞库的方法。步骤如下：分离脐带华通胶，加入无血清培养基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞长满至70％，传代；重新收集组织块，加入无血清培养基中二次培养，每5天更换一次培养基，待细胞长满至70％，传代。经传代培养，冻存后建立脐带间充质干细胞库。本发明采用了无血清培养、冻存体系建立细胞库，以及组织块二次爬片方法。本发明优势在于有效利用所有组织，让细胞尽可能的爬出，获得细胞数量是传统方法的2倍。本发明细胞培养体系采用血清替代物替代牛源血清，胰酶替代物替代猪源胰酶，有效的避免了动物源性对人源的污染，省去了检测牛源、猪源的质控环节。
【专利说明】
一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种建立脐带间充质干细胞库的新方法及细胞冻存体系。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞属于多能干细胞，其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植 入、免疫调控和自我复制等特点，所以日益受到人们的关注。间充质干细胞临床应用与解决 多种血液系统疾病、心脑血管疾病、神经系统疾病、骨关节疾病、自身免疫性疾病等方面取 得了重大突破。随着临床应用的不断发展，也间充质干细胞的质量也越来越受到关注。传统 的培养间充质干细胞的方法中都是用血清(牛源）、胰酶(猪源)体系，这种动物源的培养体 系，增加了使用者感染动物源病毒的风险，所以越来越多的研究者认为使用无动物源 (anmial free)培养体系培养间充质干细胞更具有临床价值。
【发明内容】
[0003] 本发明使用animal free培养体系培养、冻存脐带间充质干细胞，且在建立细胞库 时采用了充分利用脐带组织的二次爬片法，解决细胞库建立过程时间长、获得细胞数量少 等问题，并且对细胞质量进行检测，结果显示其细胞质量及生物能力均优于传统培养方法。
[0004] 本发明的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，它是按照以下 按照以下步骤进行的：
[0005] -、分离脐带华通氏胶:将脐带剪成1~3cm，剥离血管和表皮，分离出华通氏胶；
[0006] 二、组织块培养及细胞传代:将步骤一分离的脐带华通胶剪成小块，加入到无血清 培养基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70 %，悬浮组织块并收集，然后离 心，弃上清，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞；
[0007] 三、将步骤二重悬细胞进行离心，弃上清，用无血清培养基进行重悬，进行二次培 养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70%，悬浮组织块并收集，然后离心，弃上清，加 入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞；
[0008] 四、将步骤三的重悬细胞细胞进行离心，然后用细胞冻存液重悬至细胞密度为1~ 2 X 106/mL，分装在冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜保存后可转入液 氮罐中长期保存，即完成所述的采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的主细胞库；
[0009] 五、将步骤四的细胞继续进行传代培养，接种于T175培养瓶中，接种密度为1.5 X 104/mL，细胞接种量为3 X 105个，每瓶加入20mL无血清培养基，第3天将培养瓶内的一半培养 基更换为新鲜无血清培养基，培养至细胞密度达95 %，消化细胞后计数细胞数量达6~8 X 1〇6个后，进行传代培养至P4代，即完成建立人脐带间充质干细胞库。
[0010]本发明包含以下有益效果：
[0011]本发明采用血清替代物替代胎牛血清，有效防止了牛源特定病毒对细胞的污染。 每个批次的血清替代物无需检测牛源特定病毒，节约成本和人工。血清替代物成分明确，各 个批次之间稳定性、重复性强，规避了血清提取过程中胎牛的个体差异。
[0012] 本发明采用胰酶替代物替代猪源胰酶，有效防止了猪源特定病毒对细胞的污染。 每个批次的胰酶替代物无需检测猪源特定病毒，节约成本和人工。胰酶替代物成分明确，各 个批次之间稳定性、重复性强，规避了胰酶提取过程中猪的个体差异。
[0013] 本发明采用无血清冻存体系冻存细胞，冻存体系中无牛源血清混入，确保建立的 细胞库为无血清细胞库。
[0014] 本发明采用1、2次爬片方法培养细胞，1根脐带可培养出2倍的细胞量，且细胞质量 良好，有效的解决的样本采集困难，原代培养细胞量少的问题。
【附图说明】
[0015] 图1:实施例一的无血清培养一次爬片培养10天结果图；
[0016] 图2:实施例一的无血清培养二次爬片培养8天结果图；
[0017] 图3:实施例一的有血清培养一次爬片培养10天结果图；
[0018] 图4:实施例一的有血清培养二次爬片培养8天细胞出现老化结果图；
[0019] 图5:实施例二的有、无血清培养细胞生长曲线图；
[0020] 图6:实施例三的无血清培养细胞P7代图；
[0021]图7:实施例三的无血清培养细胞P15代图；
[0022]图8:实施例三的有血清培养细胞P7代图；
[0023]图9:实施例三的有血清培养细胞P10代图。
【具体实施方式】
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库 的方法，它是按照以下按照以下步骤进行的：
[0025] 一、分离脐带华通氏胶:将脐带剪成1~3cm，剥离血管和表皮，分离出华通氏胶； [0026]二、组织块培养及细胞传代:将步骤一分离的脐带华通胶剪成小块，加入到无血清 培养基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70 %，悬浮组织块并收集，然后离 心，弃上清，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞； [0027]三、将步骤二重悬细胞进行离心，弃上清，用无血清培养基进行重悬，进行二次培 养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70%，悬浮组织块并收集，然后离心，弃上清，加 入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞；
[0028]四、将步骤三的重悬细胞细胞进行离心，然后用细胞冻存液重悬至细胞密度为1~ 2 X 106/mL，分装在冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜保存后可转入液 氮罐中长期保存，即完成所述的采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的主细胞库； [0029]五、将步骤四的细胞继续进行传代培养，接种于T175培养瓶中，接种密度为1.5 X 104/mL，细胞接种量为3 X 105个，每瓶加入20mL无血清培养基，第3天将培养瓶内的一半培养 基更换为新鲜无血清培养基，培养至细胞密度达95 %，消化细胞后计数细胞数量达6~8 X 1〇6个后，进行传代培养至P4代，即完成建立人脐带间充质干细胞库。
【具体实施方式】 [0030] 二:本实施方式与一不同的是:分离脐带华通胶的具 体操作如下：
[0031] 将脐带组织消毒干净，剪成2cm小段，剥去血管及外皮，分离出华通氏胶组织，将组 织剪成2~3mm的小块，每个组织块重悬在lOmL无血清培养基中，即完成所述的分离脐带华 通胶操作。其它与【具体实施方式】一相同。
[0032]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:无血清培养基组分为： 体积百分含量为95 %的α-ΜΕΜ基础培养基和体积百分含量为5 %的U1 traGRO血清替代物，以 及2U/mL的肝素钠。其它与【具体实施方式】一相同。
【具体实施方式】 [0033] 四：本实施方式与一不同的是:细胞冻存液组分为:体 积百分含量为50 %的α-ΜΕΜ基础培养基和体积百分含量为50 %的无血清冻存液。其它与具 体实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0034] 五:本实施方式与一不同的是步骤二和步骤三中最终 重悬细胞的密度均为1.5 X 104/mL。其它与一相同。
[0035] 本
【发明内容】
不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个【具体实施方式】的组 合同样也可以实现发明的目的。
[0036]通过以下实施例验证本发明的有益效果：
[0037] 实施例一:原代细胞培养有无血清对比
[0038] 分离脐带，将组织块分别接种在2个T75培养瓶中，一个使用无血清培养体系培养， 另一个使用有血清培养体系培养。每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70%，将培养基 及组织块收集到离心管中，生理盐水清洗培养瓶，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理 盐水，收集细胞悬液，离心，培养基重悬细胞，计数。收集有培养基及组织块的离心管，离心， 弃上清，分别用10mL无血清有、血清培养基重悬组织块，分别接种到2个新的T75培养瓶中二 次爬片。每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70%，弃培养瓶中的培养基及组织块，生理 盐水清洗培养瓶，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，培养 基重悬细胞，计数。
[0039] 所用的无血清培养基：95%α-ΜΕΜ基础培养基+5%UltraGR0血清替代物+2U/mL肝 素钠（国药）；
[0040] 冻存体系：50% α-ΜΕΜ基础培养基+50 %无血清冻存液。
[0041 ]结果显示无血清培养基较有血清培养基培养的细胞形态较小、饱满，生长速度快。 原代培养对比结果如表1，培养结果如图1、2、3、4。
[0042]表1原代细胞培养有无血清对比表
[0044]实施例二:细胞培养有无血清倍增时间对比
[0045]使用有、无血清培养基分别接种2个24孔板，细胞接种数量为0.5*104/mL，每孔 0.5mL，每天计3孔，每孔计2次，共计5天。
[0046]结果显示无血清培养基较有血清培养基培养的细胞倍增时间快2倍。倍增时间对 比如表2,生长曲线如图5。
[0047]表2有无血清倍增时间对比表
[0050] 实施例三:细胞高代次培养及表面抗原、细胞周期对比
[0051] 每次按照1.5*104/mL密度进行细胞传代，传代结果显示无血清培养基可传代15代 以上，有血清培养基可传代9代左右。培养结果如图6、7、8、9。
[0052]每次细胞传代收集2*106个细胞进行表面抗原检测，结果显示无血清培养基培养 的1、2次爬片细胞及高代次细胞表面抗原均正常，有血清培养基培养的2次爬片细胞及高代 次细胞表面抗原出现异常，检测结果如表3。
[0053]表3有无血清对比表面抗原(流式)检测结果表
[0056] 每次细胞传代收集1*106个细胞进行细胞周期检测，结果显示无血清培养基培养 的细胞G2期比例均高于有血清培养基培养的细胞，检测结果如表4。
[0057] 表4有无血清对比细胞周期检测结果表
【主权项】
1. 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其特征在于它是按照以下 按照以下步骤进行的： 一、 分离脐带华通氏胶:将脐带剪成1~3cm，剥离血管和表皮，分离出华通氏胶； 二、 组织块培养及细胞传代:将步骤一分离的脐带华通胶剪成小块，加入到无血清培养 基中培养，每5天更换一次培养基，待细胞密度达到70%，悬浮组织块并收集，然后离心，弃 上清，加入胰酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞； 三、 将步骤二重悬细胞进行离心，弃上清，用无血清培养基进行重悬，进行二次培养，每 5天更换一次培养基，待细胞密度达到70 %，悬浮组织块并收集，然后离心，弃上清，加入胰 酶替代物，消化3min，再加入生理盐水，收集细胞悬液，离心，重悬细胞； 四、 将步骤三的重悬细胞细胞进行离心，然后用细胞冻存液重悬至细胞密度为1~2 X 106/mL，分装在冻存管中，然后将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜保存后可转入液氮 罐中长期保存，即完成所述的采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的主细胞库； 五、 将步骤四的细胞继续进行传代培养，接种于T175培养瓶中，接种密度为1.5 X 104/ mL，细胞接种量为3 X 105个，每瓶加入20mL无血清培养基，第3天将培养瓶内的一半培养基 更换为新鲜无血清培养基，培养至细胞密度达95 %，消化细胞后计数细胞数量达6~8 X 106 个后，进行传代培养至P4代，即完成建立人脐带间充质干细胞库。2. 根据权利要求1所述的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其 特征在于分离脐带华通胶的具体操作如下： 将脐带组织消毒干净，剪成2cm小段，剥去血管及外皮，分离出华通氏胶组织，将组织剪 成2~3mm的小块，每个组织块重悬在10mL无血清培养基中，即完成所述的分离脐带华通胶 操作。3. 根据权利要求1所述的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其 特征在于无血清培养基组分为:体积百分含量为95 %的α-ΜΕΜ基础培养基和体积百分含量 为5%的UltraGRO血清替代物，以及2U/mL的肝素钠。4. 根据权利要求1所述的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其 特征在于细胞冻存液组分为:体积百分含量为50 %的α-ΜΕΜ基础培养基和体积百分含量为 50%的无血清冻存液。5. 根据权利要求1所述的一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法，其 特征在于步骤二和步骤三中最终重悬细胞的密度均为1.5 X 104/mL。
【文档编号】C12N5/0775GK105970300SQ201610311244
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】芦慧颖, 张怡, 孟庆雪, 刘春香
【申请人】黑龙江天晴干细胞股份有限公司