一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应用

一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的阿维菌素人工抗原为将式I所示的阿维菌素半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供阿维菌素人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于阿维菌素抗体的制备，以及阿维菌素药物残留检测具有重大价值。
【专利说明】
一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药及化学领域，涉及一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 阿维菌素是一种广谱高效的抗寄生虫药物，兽医临床上广泛用于动物体内外寄生 虫的防治。但是，阿维菌素类药物主要作用于神经肌肉接头，具有潜在的神经毒性，且脂溶 性强，在动物体内的残留超过35天，世界卫生组织将其归为高毒化合物。阿维菌素酶联免疫 试剂盒具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品检测。
[0003] 目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化 分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也 不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优 势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在 阿维菌素的残留检测中起着越来越重要的作用。
[0004] 影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于 免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分 子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种阿维菌素人工抗原及其制备方法与应用。
[0006] 本发明所提供的阿维菌素人工抗原是在阿维菌素半抗原的基础上构建所得的抗 原。
[0007] 所述阿维菌素半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。
[0009] 本发明还提供了制备所述阿维菌素半抗原的方法。
[0010] 本发明所提供的制备所述阿维菌素半抗原的方法，具体可包括如下A-C的步骤：
[0011] A.按照包括如下步骤(1 )_(5)的方法制备中间体1:
[0012] (1)将阿维菌素溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，然后加入咪唑，混合，得到I液；
[0013] 其中，所述阿维菌素、所述二甲基甲酰胺（DMF)和所述咪唑的配比为1 g : 6m 1: 〇.47g；
[0014] (2)将叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2SiCl)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，得到II液；
[0015] 其中，所述叔丁基二甲基氯娃烷(t-BuMe2SiCl)与所述二甲基甲酰胺(DMF)的配比 为0·52g:2ml;
[0016] (3)将所述I液与所述11液混合，30 °C搅拌反应2h，得至lj III液；
[0017] 其中，所述I液中的所述阿维菌素和所述II液中的所述叔丁基二甲基氯硅烷（t-BuMe2SiCl)的配比为 lg:0.52g;
[0018] 将所述I液与所述II液混合具体为:将所述II液逐滴加入到所述I液中。
[0019] (4)采用乙酸乙酯(EtoAc)对所述III液进行萃取，分离乙酸乙酯层，MgS〇4干燥，减 压浓缩，将所得浓缩物(微黄色粘稠物)溶解于二氯甲烷(CH2C12 )，得到IV液；
[0020] (5)将所述IV液进行硅胶柱层析，采用的硅胶粒度为200-300目，洗脱液由体积比 为95:5的二氯甲烷(012(：12)、和甲醇(0130!〇混合而成，采用所述洗脱液进行洗脱后收集符 合条件A的组分，然后进行减压浓缩，真空干燥(24h，避光），得到所述中间体1;
[0021] 所述符合条件A的组分为:在以体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇的混合液作为展 开剂，以粒度为300-400目的硅胶作为固定相的薄层层析中，比移值为Rf = 0.3的组分；
[0022] B.按照包括如下步骤(6)-(9)的方法由所述中间体1制备中间体2:
[0023] (6)将所述中间体1溶解于二氯甲烷(CH2C12)后，依次加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)、 三乙胺和琥珀酸酐，得到V液；
[0024] 其中，所述中间体1、所述二氯甲烷(CH2C12)、所述4-二甲氨基吡啶(DMAP)、所述三 乙胺和所述琥珀酸酐的配比为〇. 5g: 12ml: 0.28g: 0.45g: 0.92g;
[0025] (7)将所述V液于40°C水浴回流2.5h(溶液由无色变为棕色、黑色），减压蒸干所述 二氯甲烷(CH2C12)，得到VI液；
[0026] (8)采用乙醚对所述VI液进行萃取，过滤除去不溶物，分离乙醚层，先用质量分数 为3.6 %的HC1洗涤（2次），再用水洗涤（2次），然后用MgS〇4干燥，减压浓缩，将所得浓缩物 (淡黄色粘稠物)溶解于二氯甲烷(CH 2C12)，得至IjVII液；
[0027] (9)将所述VII液进行薄层色谱分离，展开剂由体积比为95: 5: 5的二氯甲烷 (CH2C12)、四氢呋喃(THF)和甲醇(CH30H)混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶，收集 比移值(Rf)为〇. 5的区带，用由体积比为1:1的二氯甲烷(CH2C12)和甲醇(CH30H)混合而成的 淋洗液进行淋洗，减压浓缩，真空干燥(24h，避光），得到所述中间体2;
[0028] C.按照包括如下步骤(10)-( 14)的方法由所述中间体2制备所述化合物：
[0029] (10)将所述中间体2溶解于甲醇(CH30H)，得到VIII液；
[0030] 其中，所述中间体2与所述甲醇(CH30H)的配比为0.3g:17ml;
[0031] (11)将对甲苯磺酸溶解于甲醇(CH30H)，得到IX液；
[0032] 其中，所述对甲苯磺酸与所述甲醇(CH30H)的配比为0.26g:10ml;
[0033] (12)于20-25°C，将所述VIII液与所述IX液混合，搅拌反应25min，40°C减压浓缩得 到X液；
[0034] 其中，所述VIII液中的所述中间体2与所述IX液中的所述对甲苯磺酸的配比为 0.3g:0.26g;
[0035] 将所述VIII液与所述IX液混合具体为:搅拌下将所述IX液逐滴加入到所述VIII液 中。
[0036] (13)采用乙酸乙酯(EtoAc)对所述X液进行萃取，先以2 % (质量分数)NaH⑶3溶液 洗涤1次，再以水洗涤3次，然后用MgS04干燥，减压浓缩，将所得浓缩物溶解于二氯甲烷 (OfeCh)，得到 XI 液；
[0037] (14)将所述XI液进行薄层色谱分离，展开剂由体积比为90:9.5:0.5的二氯甲烷 (CH 2C12)、四氢呋喃(THF)和乙酸(HAc)混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶，收集比 移值(Rf)为0.3的区带，用乙酸乙酯(EtoAc)进行淋洗，减压浓缩，真空干燥(24h，避光），得 到所述化合物。
[0038] 在阿维菌素半抗原的基础上构建所得的阿维菌素抗原也属于本发明的保护范围。 [0039]所述阿维菌素，为将所述阿维菌素半抗原(式I)与载体蛋白偶联所得的抗原。在本 发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0040] 其中，所述阿维菌素半抗原(式I)与所述载体蛋白偶联的摩尔比为8.14:1。
[0041] 所述阿维菌素抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0042] 所述阿维菌素抗原的制备方法，具体可包括如下步骤:将所述阿维菌素半抗原(式 I)与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述阿维菌素抗原。
[0043] 在本发明中，所述阿维菌素抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
[0044] (al)将所述阿维菌素半抗原(式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20-25°C磁力搅 拌反应3h，得到溶液I;
[0045] 其中，所述阿维菌素半抗原(式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的配比为43.6mg: 1.5ml：26mg：25mg；
[0046] (a2)将所述载体蛋白置于0.1M碳酸缓冲液中，4000rpm搅拌10mn，充分溶解，得到 溶液II;所述〇. 1M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及浓度如下:碳酸钠0. lmol/L，碳 酸氢钠〇. lmol/L;所述载体蛋白与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为5〇-67mg: 3.5ml;
[0047] 其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)，则所述牛血清白蛋白（BSA)与所述 0.1M碳酸缓冲液的配比为50mg:3.5ml;若所述载体蛋白为卵清蛋白（0VA)，则所述卵清蛋白 (0VA)与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为67mg: 3.5ml;
[0048] (a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件B进行混合，混合后后于20_25°C磁力搅 拌反应24h，得到溶液III;
[0049] 所述条件B为:所述溶液I中的所述阿维菌素半抗原(式I)与所述溶液II中的所述 0.1M碳酸缓冲液的配比为43.6mg: 3.5ml;
[0050] 其中，将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在4°C条件下，将所述溶液I逐滴加 入到所述溶液Π 中，边加边搅拌；
[0051 ] (a4)用磷酸盐缓冲液(0.01M ros，pH = 7.4)，于4°C对所述溶液III搅拌透析3天， 得到所述阿维菌素抗原;所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、 氯化钠和氯化钾;所述磷酸二氢钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为〇. 27g/L，所述磷酸氢二 钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为1.42g/L，所述氯化钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为 8g/L，所述氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L;所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
[0052]所述阿维菌素半抗原(式I)或所述阿维菌素抗原在如下(a)或(b)中的应用也属于 本发明的保护范围：
[0053] (a)定性或定量检测阿维菌素；
[0054] (b)制备阿维菌素抗体。
[0055]利用所述阿维菌素抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。
[0050 ]所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。
[0057] 本发明所提供的阿维菌素半抗原，以及所述阿维菌素抗原，合成方法简单，纯度高 和产率高，对于阿维菌素抗体的制备，以及阿维菌素药物残留检测具有重大价值。
【附图说明】
[0058] 图1为阿维菌素半抗原4〃-〇_succinoylAVM的质谱检测结果。
[0059]图2为BSA的质谱检测结果。
[0060]图3为阿维菌素抗原"阿维菌素半抗原+BSA"的质谱检测结果。
【具体实施方式】
[0061 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0062]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0063]阿维菌素:百灵威科技有限公司，其产品编号为P-615N。
[0064]实施例1、阿维菌素半抗原的制备及结构鉴定
[0065] 一、阿维菌素半抗原的制备
[0066] 1、中间体5-〇-t-BuMe2Si-R-4"-OH的合成
[0067] (1)取1.0g阿维菌素(AVM)，加6mL二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合，得 到I液。
[0068] (2)取0.52g叔丁基二甲基氯硅烷(t-BuMe2SiCl)溶于2mL DMF，得到II液。
[0069] (3)机械搅拌所得I液，将所述II液逐滴加入，30 °C搅拌约2h，得到III液。
[0070] (4)向所述III液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)，混合，混合液用水洗涤(3次，每次 50mL)，分离EtoAc层，MgS04干燥，减压浓缩，将所得浓缩物(微黄色粘稠物)溶解于适量二氯 甲烷(CH2C12)，得到IV液。
[0071] (5)将所述IV液进行硅胶柱层析，采用的硅胶粒度为200-300目，洗脱液由体积比 为95:5的二氯甲烷(01 2(：12)、和甲醇(0130!〇混合而成，洗脱时的流速为1~2滴/8，采用所述 洗脱液进行洗脱后收集符合如下条件的组分:在以体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇的混合 液作为展开剂，以粒度为300-400目的硅胶作为固定相的薄层层析中，比移值为Rf = 0.3的 组分。然后减压浓缩，真空干燥24h(避光），得到中间体5-〇-t-BuMe2Si-R-4〃-OH。
[0072] 2、中间体 5-〇-t_BuM2Si-R-4〃-〇-succinoyl的合成
[0073] (1)取步骤1 合成的中间体5-〇-t-BuM2Si-R-4"-OH 0 · 50g，加12mLCH2Cl2使其溶解， 依次加入0.28g二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，得到V液。
[0074] (2)将所述V液于40°C水浴回流2.5h，溶液由无色变为棕色、黑色（与反应原料无 关），减压蒸干CH2C12,得到VI液。
[0075] (3)向所述VI液中加入100mL乙醚，过滤除去不溶物后转至250mL分液漏斗中，分离 乙醚层，先用l〇〇mL 3.6%(质量分数)此1洗涤2次，再用10〇1^水洗涤2次，然后用1^3〇4干 燥，减压浓缩，将所得浓缩物(淡黄色粘稠物）以适量CH 2C12溶解，得到VII液。
[0076] (4)将所述VII液进行薄层色谱(TLC)分离，展开剂由体积比为95:5:5的二氯甲烷 (CH 2C12)、四氢呋喃(THF)和甲醇(CH30H)混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶。TLC 出现三条区带，将中间最大的区带（比移值Rf为0.5)刮下，用由体积比为1:1的二氯甲烷 (CH2C1 2)和甲醇(CH30H)混合而成的淋洗液进行淋洗，减压浓缩，真空干燥24h(避光），得到 所述中间体 5-o-t_BuM2Si-R-4〃-〇-succinoyl 〇
[0077] 3、阿维菌素半抗原4〃 -o-succinoy 1AVM的合成
[0078] (1)将步骤2合成的中间体5-〇-t-BuM2Si-R-4"-〇-succinoyl 0 · 30g加入到17mL甲 醇使其溶解，得到VIII液。
[0079] (2)将0.26g对甲苯磺酸溶于1 OmL甲醇，得到IX液。
[0080] (3)室温（20-25°C )搅拌下，将所述IX液逐滴加入到所述VIII液中，继续搅拌 25min，40 °C减压浓缩得到X液。
[0081 ] (4)用80mL EtoAc将所述X液洗涤，转入250mL分液漏斗中，先用40mL 2%(质量分 数)NaHC03溶液洗涤1次，再以80mL水洗涤3次，然后用MgS〇4干燥，减压浓缩，将所得浓缩物用 适量CH2C12溶解，得到XI液。
[0082] (5)将所述XI液进行TLC分离纯化，展开剂由体积比为90 : 9.5 :0.5的二氯甲烷 (CH2C12)、四氢呋喃（THF)和乙酸(HAc)混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶，TLC显 示三条区带，将比移值Rf为0.3中间区带刮下，EtoAc淋洗，减压浓缩后真空干燥(避光)24h， 得到所述阿维菌素半抗原4〃-〇-succinoylAVM。
[0083] 反应方程式如下：
[0085]二、阿维菌素半抗原的结构鉴定
[0086] 结果如图1所示，对步骤一所得4〃-〇_811(^;[1107]^\^[进行质谱检测，]\1+:1+似= 995·5，Μ-:Μ-Η=971·5。
[0087] 结果显示其化学结构式如式I所示，即为阿维菌素半抗原。
[0089] 实施例2、阿维菌素人工抗原的制备及结构鉴定
[0090] 一、阿维菌素人工抗原的制备
[0091] 1、免疫原的合成
[0092] (1)将实施例1制备得到的半抗原（式1)43.61^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)26mg，N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS) 25mg，室温(20-25 °C)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
[0093] (2)称取50mg牛血清白蛋白（BSA)，溶解于3.5mL 0· 1M碳酸缓冲液中，400rpm搅拌 lOmin，充分溶解，得到溶液II。
[0094]其中，所述0. 1M碳酸缓冲液的pH为9. 6,溶剂为水，溶质及其浓度如下： Na2C〇3l.59g/L，NaHC〇3 2.94g/L。
[0095] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌， 室温(20-25 °C)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
[0096] (4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋（15cm)，lL 0.01M PBS(pH7.4) (配方:磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充 分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，即为0.01M pH7.4PBS)透析3天，4 °C搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗原编 号，-20 °C保存备用。
[0097] 2、包被原的合成
[0098] (1)将实施例1制备得到的半抗原（式1)43.61^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)26mg，N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS) 25mg，室温(20-25 °C)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
[0099] (2)称取67 · Omg卵清蛋白（0VA)，溶解于3 · 5mL 0 · 1Μ碳酸缓冲液pH = 9 · 6 (配方同 上）中，400rpm搅拌1 Omin，充分溶解，得到溶液II。
[0100] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C)环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌， 室温(20-25 °C)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
[0101] (4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋（15cm)，lL 0.01M PBS(pH7.4) (配方同上）透析3天，4°C搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min， 0.5ml/管分装，将抗原编号，-20°C保存备用。
[0102]二、阿维菌素人工抗原的鉴定
[0103] 如图2、图3所示，免疫原MALDI-T0F-MS鉴定结果显示偶联比为：1?=(74205.876-66291.676)/972.5 = 8.14。即免疫原中，所述阿维菌素半抗原(式I)与牛血清白蛋白（BSA) 偶联的摩尔比为8.14:1。
[0104] 实施例3、阿维菌素人工抗原免疫动物制备抗血清
[0105] 一、动物免疫
[0106] 用步骤实施例2获得的阿维菌素人工抗原"阿维菌素-BSA"作为免疫原免疫新西兰 大白兔，每次免疫剂量为1〇〇~200!^，免疫方式为双肩部和后大腿皮下多点注射，每个区域 大约用1/4的免疫原。首免时将免疫原用生理盐水稀释，然后与弗氏不完全佐剂进行1:1(体 积比）混合制成乳化剂，每间隔2周取相同剂量免疫原加等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后 加强免疫一次，采用此方式共加免3次后，间隔3~4周再取相同剂量免疫原加弗式不完全佐 剂进行末次免疫，耳动脉取血检测抗体效价。末次免疫7-10天后采用颈动脉放血，每只兔子 可得血100-120ml左右，取完的血在4°C冰箱放置5~6小时，然后以5000rpm离心10min，分离 血清。
[0107] 二、抗血清效价测定
[0108] 采用间接ELISA法测定步骤一所得血清的抗体效价，具体如下：
[0109] 1)包被:在96孔酶标板中加入1 OOyL浓度为2yg/mL的"阿维菌素-OVA"溶液(用包被 缓冲液进行稀释），同时设置不包被抗原的对照，4°C包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
[0110]包被缓冲液:PH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓 度如下：Na2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0111] 2)封闭：加入150μ!7孔的封闭液，在37 °C孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4 °(：冰箱保存备用。
[0112] 封闭液:含有0.5% (体积百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸盐缓 冲液，PH7.4。
[0113] 3)加待测样品：吸取不同稀释度的待测血清100μΙ，加入对应的酶标板中，37°C孵 育30min，洗板4次，拍干。
[0114] 同时设置未经免疫的兔血清的对照；以PBS代替待检测样品的对照（阴性对照孔）。
[0115] 4)加酶标二抗:取HRP标羊抗兔IgG抗体(Jackson ImmunoResearch公司，货号111-035-003)，按体积比1:5000倍稀释后，100μΙ/孔，37°C孵育20至30min，洗涤4次，拍干。
[0116] 5)显色:将 20 X TMB 稀释至1 X TMB，按100μΙ/孔加入，37 °C 显色 15-30min。
[0117] 6)终止:加入终止液(2M H2S〇4)50yl/孔。
[0118] 7)读数：以450nm单波长测定各孔0D值，以与阴性对照孔（以PBS代替待测样品的对 照)0D值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为血清效价的临界点。
[0119] ELISA结果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀释倍数表示。
[0120] 结果表明血清中的抗体效价为1:16000。
[0121] 实施例4、阿维菌素酶联免疫试剂盒检测阿维菌素
[0122] -、阿维菌素酶联免疫试剂盒的组装
[0123] 1、阿维菌素酶联免疫试剂盒的组成包括如下：
[0124] (1)阿维菌素标准品工作液:6瓶，1.5mL/瓶，浓度为0ng/ml、0.5ng/ml、l .5ng/ml、 4.5ng/ml、13·5ng/ml、40·5ng/ml;
[0125] ⑵阿维菌素酶标板：1块(8孔X 12条），为包被了实施例2制备得到的"阿维菌素-0VA"的酶标板。
[0126] (3)酶标记物稀释液：1瓶(1 OmL)，为PBS。
[0127] (4)酶标记物工作液：1瓶（11 X，lmL)，其中酶标记物具体为辣根过氧化酶标记的 抗阿维菌素的抗体，所述抗体为实施例3制备得到的抗血清。
[0128] (5)样品稀释液：1 瓶(50ml)，为0.1M ρΗ7·4的PBS。
[0129] (6)洗涤液：1 瓶（20Χ，25mL)，为0.01mol/L ρΗ7·4的PBST溶液。
[0130] (7)底物Α液、底物Β液各1瓶(7mL)。其中，底物Α为2%过氧化脲水溶液。底物Β为1 % 四甲基联苯胺水溶液。
[0131] (8)终止液：1瓶(7mL)，为2mol/L H2S〇4溶液。
[0132] (9)盖板膜；
[0133] (10)自封袋。
[0134] 2、需要而未提供的设备和材料
[0135] (1)设备
[0136] 酶标仪(检测波长450nm，参考波长630nm)、漩涡振荡器、离心机(4000g)、氮吹仪、 微量移液器、计时器。
[0137] (2)试剂
[0138] 25%甲醇缓冲液:准确量取5mL甲醇和15mL样品稀释液，混匀备用。
[0139] 乙腈(分析纯）、正己烷(分析纯）。
[0140] 3、贮存
[0141] 该试剂盒贮存于2_8°C，切勿冷冻，有效期1年。
[0142] 未使用完的酶标板条应密封，2_8°C保存。
[0143] 4、试剂盒检测原理
[0144] 样品中的阿维菌素与酶标板上固定的抗原特异性竞争酶标记物，通过酶催化底物 显色，根据显色的深浅来判断样品中阿维菌素的含量。含量少，显色深;含量多，显色浅。
[0145] 二、阿维菌素酶联免疫试剂盒的使用方法
[0146] 1、样品前处理
[0147] (1)原奶方法一(稀释系数:2)
[0148] a)取lmL新鲜原奶于10mL离心管中，加入3mL甲醇，高速祸动lmin;b)4000g离心 10min; c)取lmL上清于4mL离心管中，50 °C水浴中氮气吹干;d)加入0.5mL 25 %甲醇缓冲液 (见步骤一2)，充分涡动lmin;e)取50yL进行检测。
[0149] (2)原奶方法二(稀释系数:10)
[0150] a)取lmL新鲜原奶于10mL离心管中，加入3mL甲醇，充分祸动lmin;b)4000g离心 10min; c)取300yL上清液于新的离心管中，加入600yL样品稀释液，充分祸动lmin; d)取50yL 进行检测。
[0151] (3)鸡肉、猪肉、鸡肝(稀释系数:4)
[0152] a)准确称取2±0.01g均质后的组织样品于50mL离心管中；b)依次加入3mL正己烷、 6mL乙腈，迅速逐一祸散后，高速祸动lmin; c )4000g离心10min，弃去上层正己烧;d)取2.7mL 上清液于4mL离心管中，离心管中预先加入0.4g纯化剂A和0.5g纯化剂B，立即高速涡动 lmin;e)4000g离心5min;f)取lmL上清液于4mL离心管中，60°C水浴中氮气吹干;g)猪肉、鸡 肉样本:先加入250yL甲醇，祸动5s后加入750yL样品稀释液;鸡肝样本:先加入150yL甲醇， 涡动5s后加入850yL样品稀释液;h)高速涡动lmin; i)取50yL进行检测。
[0153] 2、检测步骤
[0154] (1)将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平 行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2_8°C环境中；
[0155] (2)将50yL各浓度的阿维菌素标准品工作液(或待测样品溶液)分别加入对应的标 准品(或待测样品孔)中；
[0156] (3)在每孔中加入80yL酶标记物工作液(见步骤1);
[0157] (4)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25 ± 2 °C )，避光反应 40min；
[0158] (5)揭开盖板膜；
[0159] (6)倒掉板孔中液体，在每孔加入260yL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s ；
[0160] (7)倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
[0161] (8)立即在每孔中加入lOOyL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按体 积1:1混合，必须充分混勾，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂）；
[0162] (9)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25 ± 2 °C )，避光反应10-15min；
[0163] (10)揭开盖板膜，在每孔中加入50yL终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；
[0164] (11)终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。
[0165] 3、结果计算或判定
[0166] (1)各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标(浓度为Ong/ml的标准品） 吸光度值，乘以1〇〇,可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
[0168] (2)以各标准品的百分吸光度值为纵坐标，以对应的阿维菌素浓度为横坐标绘制 标准曲线。
[0169] (3)将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度， 再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中阿维菌素的实际含量。
[0170] 三、阿维菌素酶联免疫试剂盒检测阿维菌素
[0171] 1、特异性检测
[0172] 阿维菌素酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确 定的。交叉反应越小，特异性越好。
[0173] 将阿维菌素及其它类似物(伊维菌素、埃普菌素、多拉菌素)分别做系列稀释，分别 按照如上步骤二2进行操作，以阿维菌素及其它类似物的系列稀释液替代其中的"阿维菌素 标准品工作液"，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度（IC5Q)，具体方法如下： 得到纵坐标数值等于50%对应的阿维菌素浓度(ng/mL)，即IC5Q值。用下式计算试剂盒对阿 维菌素和各类似物的交叉反应率。
[0175] 结果如表1所示，从表1中可以看出，阿维菌素酶联免疫试剂盒对各种类似物的交 叉反应率均小于1%。这说明阿维菌素酶联免疫试剂盒对阿维菌素具有极高的特异性，可有 效的排除其它类似物的干扰，可专门用于阿维菌素的检测。
[0176] 表1阿维菌素酶联免疫试剂盒的特异性
[0178] ~2、不同样品的最低检测限测定
[0179] 分别测定采用阿维菌素酶联免疫试剂盒对原奶、鸡肝、猪肉和鸡肉中阿维菌素进 行检测时的最低检测限。具体方法如步骤二。
[0180] 结果显示，采用以上步骤二2(1)中的样品前处理方法处理原奶，测得的最低检测 限可达2ng/ml(即每ml原奶中含有2ng的阿维菌素即可被检测到，下同）；采用以上步骤2(2) 中的样品前处理方法处理原奶，测得的最低检测限可达5ng/ml;采用以上步骤2(3)中的样 品前处理方法处理鸡肝、猪肉和鸡肉，测得的最低检测限可达2ng/g。
[0181] 3、阿维菌素酶联免疫试剂盒板内板间误差的测定
[0182] 分别测定阿维菌素酶联免疫试剂盒的板内误差和板间误差。具体方法如步骤二。
[0183] 结果显示，试剂盒吸光度的板内误差小于5%，板间误差小于10%。
[0184] 4、阿维菌素酶联免疫试剂盒检测阿维菌素的回收率测定
[0185] 测定采用阿维菌素酶联免疫试剂盒检测阿维菌素的回收率。具体方法如步骤二。 [0186]结果显示，采用阿维菌素酶联免疫试剂盒检测阿维菌素的回收率范围为90% ± 30% 〇
[0187] 5、阿维菌素酶联免疫试剂盒的灵敏度测定
[0188] 测定阿维菌素酶联免疫试剂盒的灵敏度。具体方法如步骤二。
[0189]结果显示，阿维菌素酶联免疫试剂盒的灵敏度为0.5ppb，标准曲线范围0.5ppb-40 · 5ppb (注：ppb=yg/kg)。
【主权项】
1. 一种化合物，其结构如式I所示：2. 制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下A-C的步骤： A. 按照包括如下步骤(1 )-(5)的方法制备中间体1: (1) 将阿维菌素溶解于二甲基甲酰胺，然后加入咪唑，混合，得到I液； 其中，所述阿维菌素、所述二甲基甲酰胺和所述咪唑的配比为lg:6ml:0.47g; (2) 将叔丁基二甲基氯硅烷溶解于二甲基甲酰胺，得到II液； 其中，所述叔丁基二甲基氯硅烷与所述二甲基甲酰胺的配比为〇. 52g: 2ml; (3) 将所述I液与所述11液混合，30 °C反应2h，得到III液； 其中，所述I液中的所述阿维菌素和所述II液中的所述叔丁基二甲基氯硅烷的配比为 lg：0.52g； (4) 采用乙酸乙酯对所述III液进行萃取，分离乙酸乙酯层，MgS04干燥，减压浓缩，将所 得浓缩物溶解于二氯甲烷，得到IV液； (5) 将所述IV液进行硅胶柱层析，采用的硅胶粒度为200-300,洗脱液由体积比为95:5 的二氯甲烷和甲醇混合而成，采用所述洗脱液进行洗脱后收集符合条件A的组分，然后进行 减压浓缩，真空干燥，得到所述中间体1; 所述符合条件A的组分为:在以体积比为95:5的二氯甲烷和甲醇的混合液作为展开剂， 以粒度为300-400目的硅胶作为固定相的薄层层析中，比移值为Rf = 0.3的组分； B. 按照包括如下步骤(6)-(9)的方法由所述中间体1制备中间体2: (6) 将所述中间体1溶解于二氯甲烷后，依次加入4-二甲氨基吡啶、三乙胺和琥珀酸酐， 得到V液； 其中，所述中间体1、所述二氯甲烷、所述4-二甲氨基吡啶、所述三乙胺和所述琥珀酸酐 的配比为 0.5g:12ml:0.28g:0.45g:0.92g; (7) 将所述V液于40°C水浴回流2.5h，减压蒸干所述二氯甲烷，得到VI液； (8) 采用乙醚对所述VI液进行萃取，分离乙醚层，先用质量分数为3.6%的HC1洗涤，再 用水洗涤，然后用MgS04干燥，减压浓缩，将所得浓缩物溶解于二氯甲烷，得到VII液； (9) 将所述VII液进行薄层色谱分离，展开剂由体积比为95:5:5的二氯甲烷、四氢呋喃 和甲醇混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶，收集比移值为0.5的区带，用由体积比 为1:1的二氯甲烷和甲醇混合而成的淋洗液进行淋洗，减压浓缩，真空干燥，得到所述中间 体2; C.按照包括如下步骤(10)-(14)的方法由所述中间体2制备所述化合物： (10) 将所述中间体2溶解于甲醇，得到VIII液； 其中，所述中间体2与所述甲醇的配比为0.3g: 17ml; (11) 将对甲苯磺酸溶解于甲醇，得到IX液； 其中，所述对甲苯磺酸与所述甲醇的配比为〇.26g: 10ml; (12) 于20-25°C，将所述VIII液与所述IX液混合，反应25min，40°C减压浓缩得到X液 其中，所述VIII液中的所述中间体2与所述IX液中的所述对甲苯磺酸的配比为0.3g: 〇.26g； (13) 采用乙酸乙酯对所述X液进行萃取，先以质量分数为2%的NaHC03溶液洗涤，再以水 洗涤，然后用MgS0 4干燥，减压浓缩，将所得浓缩物溶解于二氯甲烷，得到XI液； (14) 将所述XI液进行薄层色谱分离，展开剂由体积比为90:9.5:0.5的二氯甲烷、四氢 呋喃和乙酸混合而成，固定相是粒度为300-400目的硅胶，收集比移值为0.3的区带，用乙酸 乙酯进行淋洗，减压浓缩，真空干燥，得到所述化合物。3. 阿维菌素抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。4. 根据权利要求3所述的阿维菌素抗原，其特征在于:所述载体蛋白为牛血清白蛋白或 卵清蛋白。5. 根据权利要求3或4所述的阿维菌素抗原，其特征在于:权利要求1所述化合物与所述 载体蛋白偶联的摩尔比为8.14:1。6. 权利要求3-5中任一所述的阿维菌素抗原的制备方法，包括如下步骤:将权利要求1 所述化合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述阿维菌素抗原。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤： (al)将权利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3_二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，20-25°C反应3h，得到溶液I; 所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐、 所述N-羟基琥泊酰亚胺的配比为43.6mg: 1.5ml: 26mg: 25mg; (a2)将所述载体蛋白溶解于0.1M碳酸缓冲液中，得到溶液II; 所述载体蛋白与所述〇. 1M碳酸缓冲液的配比为50-67mg: 3.5ml; (a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件B进行混合，混合后后于20-25°C反应24h，得 到溶液III; 所述条件B为:所述溶液I中的所述化合物与所述溶液II中的所述0.1M碳酸缓冲液的配 比为43 ? 6mg: 3 ? 5ml; (a4)用磷酸盐缓冲液，于4°C对所述溶液III透析3天，得到所述阿维菌素抗原。8. 权利要求1所述化合物或权利要求3-5中任一所述的阿维菌素抗原在如下(a)或(b) 中的应用： (a) 定性或定量检测阿维菌素； (b) 制备阿维菌素抗体。9. 利用权利要求3-5中任一所述的阿维菌素抗原制备的抗体。
【文档编号】C07H1/00GK106046083SQ201610387441
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】刘志萍, 苏丽芳, 吴小平, 于书英, 秦誉, 温凯, 王照鹏, 王文珺, 杨柳, 邢维维, 陈银辉, 丁亚芳
【申请人】北京维德维康生物技术有限公司, 西南大学