一种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及蛋白质聚合体分子大小测定及鉴定技术领域，尤其涉及一种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法。步骤如下：提取作物组织可溶性总蛋白；利用改良的BNE电泳体系分离作物组织可溶性总蛋白；测定凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶的活性，扫描凝胶图像；凝胶经考马斯亮蓝染色后，扫描图像，合并两张图像，利用软件分析谷氨酰氨合成酶同工酶的大小；依据谷氨酰氨合成酶同工酶的大小及亚基性质，分析计算谷氨酰氨合成酶同工酶的聚合状态。本发明能快速了解作物GS同工酶全酶的大小、聚合状态级表达调控情况，为选育氮高效品种提供分子基础。
【专利说明】
一种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及蛋白质聚合体分子大小测定及鉴定技术领域，尤 其涉及一种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法。
【背景技术】
[0002] 氮素是影响作物产量和品质的主要元素，无论是来源于硝酸盐、氨离子、微生物固 定氮还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶(GS)催化才能同化为氨基 酸。高等植物中有两类GS，一类为胞液型GS，即GSl，主要参与种子萌发时储存氮源的转运及 叶片衰老时氮源的转移及再利用；另一类为质体型GS，即GS2,主要参与光呼吸、硝酸还原产 生的氨(初级氮)的同化过程。了解这两类GS同工酶在作物生长发育过程中的动态变化对选 育氮高效品种具有重要意义。目前分离鉴定具有活性蛋白质的方法主要有传统的层析技术 和离心技术，需要样品量大耗时长，而且仪器设备昂贵，只适合于定性分析，无法实现定量 分析。BNE技术已成功运用于动物线粒体膜蛋白分离鉴定，但不适合于可溶性蛋白质的分 离，其体系中大量的考马斯亮蓝一方面导致蛋白质解聚，另一方面由于作物叶片中大量的 RuBP羧化酶在电泳过程中染色干扰，影响其它蛋白质的鉴定。本专利通过改进BNE系统的上 洋缓冲液，电泳技术，使其适合于作物GS同工酶的分离和胶内活性测定，该方法可简便快速 地用于GS同工酶表达的定量分析，也可以用于其他植物GS同工酶的分离及大小鉴定，是研 究GS聚合状态的快速有效的方式。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种适合于作物谷氨酰氨合成酶同工酶的分离、胶内活性 测定及全酶大小测定的方法，是研究谷氨酰氨合成酶聚合状态及其表达的快速有效的方 法。
[0004] 为实现上述目的，目的本发明采用以下技术方案：
[0005] -种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，步骤如下：
[0006] (1)提取作物组织可溶性总蛋白；
[0007] (2)利用改良的BNE电泳体系分离作物组织可溶性总蛋白；
[0008] (3)测定凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶的活性，扫描凝胶图像；
[0009] (4)凝胶经考马斯亮蓝染色后，扫描图像，合并两张图像，利用软件分析谷氨酰氨 合成酶同工酶的大小；
[0010] (5)回收凝胶内的谷氨酰氨合成酶同工酶条带，利用LC-MS技术或western-blot技 术鉴定谷氨酰氨合成酶同工酶亚基性质。
[0011] 所述步骤(1)的操作为:称取0.5g新鲜组织，加液氮研磨后，加入1-2.5mL提取缓冲 液，于4°C，13，OOOg条件下离心30min，取上清液备用。
[0012] 所述步骤（1)中提取缓冲液的配方为：IOOmM Tris-HCKlmM EDTAUmM MgCl2和 ΙΟπιΜβ-巯基乙醇，ρΗ7·6。
[0013] 所述步骤(2)中利用BNE电泳体系分离作物组织可溶蛋白方法:取上清液80yL与20 yL50 %甘油混匀后，取40-80yL加入3-13 %的梯度胶的加样孔中，在BNE电泳体系的阴极中 加入pH7.0的阴极缓冲液I，在BNE电泳体系的阳极中加入pH7.0的阳极缓冲液，于4°C，100-1IOV条件下电泳20-25min，暂停电泳，更换阴极缓冲液Π 后，进行15mA的稳流电泳，至电泳 前沿的蓝色条带跑出胶外。
[0014] 所述的阴极缓冲液I组成为：50mM Tricine、7.5mM咪唑、和0.02%G-250，pH7.0;阴 极缓冲液Π 组成为:50mM Tricine、7.5mM咪唑，pH7.0;所述阳极缓冲液组成为pH7.0的25mM 咪唑。
[0015] 所述步骤(3)的操作为：电泳结束后，在活性染色液A中加入成份B，混匀后，把步骤 (2)中得到的凝胶置于染色液中，37 °C缓慢摇动30-35min，去除染色液，加反应终止液，缓慢 晃动0.5-1.5min至出现棕色条带，4°C蒸馏水冲洗凝胶并扫描凝胶。
[0016] 所述的活性染液A的配方为：1.792g Tricine，0.624g Na2As〇4,0.2407g MgS〇4， 0 · 0398gEDTA，加水定容至IOOmL，pH 7 · 4;成分B为：0 · 7055g L-GLn，0 · 147g羟胺，0 · 0214g ADP0
[0017] 所述的反应终止液组成为5%1^、10%卩6(：13、2.51!1(：1。
[0018] 所述步骤(4)的操作为:对凝胶进行考马斯亮蓝染色20min，过夜脱色，用蒸馏水洗 涤后，进行第二次凝胶扫描，重合两张扫描结果图，利用quantity-One软件分析谷氨酰氨合 成酶同工酶大小。
[0019] 所述步骤(5)的操作为：回收凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶带，放入含1%SDS，1% β-巯基乙醇中，37 °C浸泡2h，去离子水清洗胶条3-5次，切取胶条塞入预制的1.5mm厚12 % SDS-PAGE凝胶孔中，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，利用western-blot鉴定谷氨酰氨合成 酶同工酶性质；或切胶回收谷氨酰氨合成酶同工酶活性带，利用质谱技术鉴定谷氨酰氨合 成酶同工酶的性质。
[0020] 本发明的有益效果在于:本发明能快速了解作物GS同工酶全酶表达调控情况，为 选育氮高效品种提供分子基础。本发明可简便快速地用于作物GS同工酶聚合状态分析，是 利用晶体技术研究蛋白质结构的有效辅助手段;也可以用于其他植物GS同工酶的分离机大 小鉴定，是研究GS聚合状态的快速有效的方式。
【附图说明】
[0021] 图1为作物GS同工酶分离鉴定及大小测定结果图；其中A为改进BNE系统分离作物 叶片可溶蛋白，结合胶内GS活性分析鉴定GS同工酶;B为BNE后进行考马斯亮蓝染色后，显示 蛋白质Marker及作物可溶蛋白条带；C为图IA和图IB重合，依据蛋白质Marker，利用 quantity-one软件分析GS同工酶的大小；Os代表水稻；Ta代表小麦；Zm代表玉米；M为 Marker0
[0022]图2为作物GS同工酶分离western-blot鉴定结果图；其中U为图IA所示的胶上部GS 活性带;L为图IA所示的胶下部GS活性带。
【具体实施方式】
[0023]下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步的解释说明：
[0024] (I)提取作物组织可溶性总蛋白
[0025] 称取0.5-1克新鲜叶片，加液氮研磨，加入l-2mL的提取缓冲液（IOOmM Tris-HCU ImM EDTA、ImM MgCl2和ΙΟπιΜβ-巯基乙醇，pH7·6，于4°C)浸提；将组织匀浆转入1 ·5-2mL的EP 管，于4°C、13000g/min条件下离心30min，取上清液置于冰上备用。
[0026] (2)加入样品，利用BNE电泳体系分离作物组织可溶性总蛋白
[0027] 先用阳极缓冲液配1%琼脂糖的封口胶封口，再用梯度仪灌制4-13%的凝胶梯度， 待分离胶(如表1所示)凝固后，灌制合适体积的浓缩胶(如表1所示）。凝胶制备好之后可以 用CldH 2O湿润的餐巾纸包被后装入自封袋，于4°C保存备用。取步骤（1)上清液SOyL与20μ L50 %甘油混匀后，取40-80yL加入3-13 %的梯度胶加样孔。在BNE电泳体系的阴极中加入 pH7.0的阴极缓冲液I (50mM Tricine、7.5mM咪唑、和0.02%G-250，pH7.0)直至淹没加样孔， 在BNE电泳体系的阳极中加入1 /3凝胶高度的阳极缓冲液(pH7.0，25mM咪唑），于4°C，100-IlOV条件下电泳20-25min至样品进入分离胶如表1所示配方;暂停电泳，更换阴极缓冲液Π (pH7.0，50mM Tricine、7.5mM咪唑）后，通15mA的稳流电泳，至电泳前沿的蓝色条带跑出胶 外，约4-5个小时。
[0028] 表 1
Luuju」 列可：gjAB-；3MiXtfJ 目t/j 73 : Acrylamide，48g; t)U % 探疋月父，丄UUmL; BisacryIamide， 1.5g;灭菌CldH2O溶解，定容IOOmL;棕色试剂瓶，4°C保存；
[0031]②3*gel Buffer(pH7.0，1.5M 6-氨基己酸、75mM咪唑-HCl)的配方为：取75mL的 2M6-氨基己酸与7.5mL的IM咪唑混匀，调pH至7.0，加 CldH2O定容至IOOmL，4°C保存。
[0032] ③IM咪唑-HCl的配方为：6.81g咪唑，灭菌CldH2O溶解，浓HCl调pH至7.0，定容至 IOOmL;
[0033] ④2M 6-氨基己酸的配方为：26.24g 6-氨基己酸，灭菌ddH2〇溶解，定容至IOOitiLd
[0034] (3)测定凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶的活性，图像扫描凝胶
[0035]电泳结束后，取出凝胶，切除浓缩胶，置于合适的白瓷盘中；在活性染色液A (1.792g Tricine，0.624g砷酸三钠 Na2As〇4,0.2407g MgS〇4,0.0398g EDTA，调pH至7.4,加 水定容至IOOmL，预先配好于4°C保存），中加入成份B(0.7055g L-GLn，0.147g羟胺，0.0214g ADP预先称量好于4°C保存），混匀后加入含凝胶的白瓷瓶中，于37°C缓慢摇动30-35min，倒 掉染色液，加反应终止液1〇〇111以含5%^^、10^^6(：1 3、2.51!1(：1)，缓慢晃动约21^11至出现 棕色条带，4°C蒸馏水冲洗凝胶3次，迅速扫描凝胶(图1A)。
[0036] (4)凝胶经常规的考马斯亮蓝染色脱色后，扫描凝胶图像（图1B)，利用Photoshop 重合两张图像（图1C)，以Native-marker为对照，利用软件quantity-One分析谷氨酰氨合成 酶同工酶的大小。
[0037] (5)利用手术刀切取步骤（3)凝胶内的谷氨酰氨合成酶同工酶条带，放入含1 % SDS，1%β-巯基乙醇中，37°C浸泡2h;用5倍处理液体积的去离子水清洗胶条3次;切取合适 大小的胶条塞入预制的1.5mm厚12%SDS-PAGE凝胶孔中，通过常规SDS-PAGE电泳分离蛋白 质和转膜，以GS抗体为探针，通过常规的western-blot鉴定谷氨酰氨合成酶同工酶亚基种 类及大小（图2);或回收的谷氨酰氨合成酶同工酶活性带，直接利用LC-MS技术可以直接鉴 定GS同工酶亚基的种类。
[0038] (6)依据谷氨酰氨合成酶同工酶的大小及亚基组成分析其聚合状态。小麦、水稻的 GSl是12聚体;玉米的GSl是10聚体;小麦、玉米和水稻的GS2都是6聚体。
【主权项】
1. 一种快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征在于:步骤如下： (1)提取作物组织可溶性总蛋白； (2 )利用改良的BNE电泳体系分离作物组织可溶性总蛋白； (3) 测定凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶的活性，扫描凝胶图像； (4) 凝胶经考马斯亮蓝染色后，扫描图像，合并两张图像，利用软件分析谷氨酰氨合成 酶同工酶的大小； (5) 回收凝胶内的谷氨酰氨合成酶同工酶条带，利用LC-MS技术或western-blot技术鉴 定谷氨酰氨合成酶同工酶亚基性质。2. 如权利要求1所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤(1)的操作为:称取〇. 5g新鲜组织，加液氮研磨后，加入1-2.5mL提取缓冲液， 于4°C，13,000 g条件下离心30min，取上清液备用。3. 如权利要求2所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤（1)中提取缓冲液的配方为：l〇〇mM Tris-HCl、lmM EDTA、lmM MgCl2和10 mM β-巯基乙醇，pH7.6。4. 如权利要求2所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤(2)中利用BNE电泳体系分离作物组织可溶蛋白方法:取步骤(1)得到的上清 液80yL与20yL 50%甘油混匀后，取40-80yL加入3-13%的梯度胶的加样孔中，在BNE电泳体 系的阴极中加入PH7.0的阴极缓冲液I，在BNE电泳体系的阳极中加入pH7.0的阳极缓冲液， 于4°C，100-110V条件下电泳20-25min，暂停电泳，更换阴极缓冲液Π 后，进行15mA的稳流电 泳，至电泳前沿的蓝色条带跑出胶外。5. 如权利要求4所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述的阴极缓冲液I组成为:50mM Tricine、7.5mM咪唑、和0.02% G-250，pH7.0;阴极 缓冲液Π 组成为:50mM Tricine、7.5mM咪唑，pH7.0;所述阳极缓冲液组成为pH7.0的25mM 咪唑。6. 如权利要求1所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤(3)的操作为：电泳结束后，在活性染色液A中加入成份B，混匀后，把步骤(2) 中得到的凝胶置于染色液中，37 °C缓慢摇动30-35min，去除染色液，加反应终止液，缓慢晃 动l-2min至出现棕色条带，4°C蒸馏水冲洗凝胶并扫描凝胶。7. 如权利要求6所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于：所述的活性染液 A 的配方为：1.792g Tricine，0.624g Na2As〇4,0.2407g MgS〇4， 0.0398g EDTA，加水定容至 100mL，pH 7.4置于4°C;成分B为：0.7055g L-GLn，0.147g羟胺， 0.0214g ADP置于4°C。8. 如权利要求6所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述的反应终止液组成为5% TCA、10%FeCl3、2.5M HC1。9. 如权利要求1所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤(4)的操作为:对凝胶进行考马斯亮蓝染色20min，过夜脱色，用蒸馏水洗涤 后，进行第二次凝胶扫描，重合两张扫描结果图，利用quantity-One软件分析谷氨酰氨合成 酶同工酶大小。10. 如权利要求1所述的快速分离测定作物谷氨酰氨合成酶同工酶大小的方法，其特征 在于:所述步骤(5)的操作为：回收凝胶内谷氨酰氨合成酶同工酶带，放入含1% SDS，1% β-巯基乙醇中，37°C浸泡2h，去离子水清洗胶条3-5次，切取胶条塞入预制的1.5mm厚12% SDS-PAGE凝胶孔中，通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，利用western-blot鉴定谷氨酰氨合成酶同 工酶性质；或切胶回收谷氨酰氨合成酶同工酶活性带，利用质谱技术鉴定谷氨酰氨合成酶 同工酶的性质。
【文档编号】C12Q1/25GK106086156SQ201610427277
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】王小纯, 韦昊, 韦一昊, 张浩然, 马新明
【申请人】河南农业大学