噻唑橙苯乙烯类化合物作为G-四链体核酸荧光探针的制作方法

本发明涉及一种荧光探针及其制备方法，以及其在水溶液中、凝胶中和细胞中检测核酸G-四链体二级结构的用途。

背景技术：

核酸不但是一切生物细胞的基本成分，还对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。核酸大分子分为两类：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。

G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的核酸二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。

G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

随着生物技术的发展，对于核酸标记的要求越来越高，以往通过同位素效应来进行DNA分子测序的方法已经无法满足需求，而荧光标记作为一种具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点的标记技术受到广泛重视，并取得迅速发展。已经发现的染色剂有卟啉类、菁类、苯乙烯类等。而其中的噻唑橙(TO)是一种经典的非选择性菁类核酸荧光探针。除了与其他核酸结合后产生荧光外，TO同样可以结合在G-四链体上，产生强烈的荧光。但是，TO不能从其他形式的核酸分子中有效地识别G-四链体二级结构，因而选择性较差限制了TO的应用。为了改良TO的选择性，我们在TO的结构上引入了苯乙烯基团，得到了一类结构新颖的，且对核酸G-四链体结构专一性强的的荧光探针。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种荧光探针。

本发明的另一个目的在于提供上述探针的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体结构的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供了一种荧光探针，其结构式为下式I所示：

式中R₁选自或

R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇分别选自H、F、Cl、Br、OH、OCH₃、N(CH₃)₂、C_1-6的烷基或C_3-6的环烷基；

X为C或N。

本发明同时提供了上述探针的制备方法，表示如下：

具体步骤为：

将4-氯-2-甲基喹啉与碘甲烷反应，得到化合物将2-甲基苯并噻唑与碘甲烷反应，得到然后将和反应，得到 最后将和不同取代基的芳香醛反应，得到最终探针化合物

本发明还提供了上述探针在检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体结构的应用。

本发明提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和平面，探针分子内的电荷转移效应的强弱可以影响分子的荧光发射强度。当与G-四链体结构发生特异性的作用后，分子内的可转动的双键的柔性受到限制，使分子内电荷转移效应增强，荧光也有明显增强。同时，该类探针的分子结构的柔性的共轭平面，具有可以转动的键，使其可以比较容易堆积在G四分体的平面上，进而与G-四链体具有较强的作用力，同时与其他二级结构的核酸作用较弱。所以，将该探针与不同二级结构的核酸混合时，如果该核酸是G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当核酸的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存。

(2)本发明提供的探针具有较低的生物毒性、光毒性和光漂白性，且光稳定性佳。

(3)本发明提供的探针具有良好的水溶性和良好的细胞膜通透性。

(4)本发明提供的探针的光谱范围与生物样品的光谱范围有足够大的差异，在非G-四链体存在的溶液及细胞内具有较低的荧光背景。

(5)本发明提供的探针可以特异性地检测识别G-四链体结构，实现了G-四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱仪，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察就可以识别出核酸样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。

附图说明

图1为为探针6a与AT、DA21、LQ1、Oxy28、random、RNA六种核酸在1∶1浓度 下的荧光谱。

图2为探针6a滴定四链DNA(Oxy28)的荧光光谱。

图3为探针6a滴定四链DNA(Oxy28)的荧光光谱中C与(F-F₀)/F₀拟合的曲线.

图4为探针6a与双链DNA(ds26)和G-四链体(Oxy28)的聚丙酰胺凝胶电泳图

图5为染料DAPI染PC3细胞的细胞成像图.

图6为探针6a染PC3细胞的细胞成像图.

图7为探针6a与染料DAPI复染PC3细胞的细胞成像图.

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。通过荧光光谱实验证明，本发明涉及的化合物6a由于具有较大的电子共轭体系和平面，与G-四链体结构发生特异性的堆积作用后，荧光光谱发生明显变化，荧光强度增加百倍，甚至只需普通紫外灯照射下，肉眼观察，同时与其他二级结构的核酸作用较弱，没有明显的荧光信号响应，使该类探针具有很好的特异性识别作用。所以，我们将该探针与不同二级结构的DNA混合时，当该DNA为G-四链体结构时，其与探针分子间的特异性作用，产生荧光光谱的改变。当DNA的二级结构为其他结构时，则不会产生明显的信号变化。以其中化合物6a为例来说明本发明的荧光探针在荧光法(包括荧光显微镜和荧光凝胶成像仪)检测水溶液中、凝胶中和细胞中G-四链体核酸二级结构的应用。

实施例一：化合物2的合成

往25ml圆底烧瓶里称取4-氯-喹哪啶0.2g(1.1236mmol)，加入碘甲烷，溶剂环丁砜，将混合物加热到40～60℃，反应18个小时后，冷却，加入无水乙醚后震荡，抽滤，固体洗涤数遍，真空干燥后称重，薄层色谱法初步表明没有副产物，得到0.345g纯品2，产率为95.8％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.56(d，J＝8.4Hz，1H)，8.46(d，J＝8.3Hz，1H)，8.22(t，J＝8.1Hz，1H)，8.01(t，J＝7.9Hz，1H)，7.55(s，J＝7.4Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.74(s，1H)，2.68(s，3H).

实施例二：化合物4的合成

往25ml的圆底烧瓶里称取2-甲基-苯并噻唑0.25g(1.68mmol)，加入碘甲烷、溶剂无水乙醇，80℃下反应15个小时后，将反应后的溶液冷却至室温，然后加入无水乙醇和三氯甲烷混合液，振荡后抽滤，并用少量试剂洗涤沉淀，真空干燥后得到白色粉末状固体0.448g，收率为91.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.44(d，J＝8.1Hz，1H)，8.30(d，J＝8.4Hz，1H)，7.90(t，J＝7.8Hz，1H)，7.81(t，J＝7.7Hz，1H)，4.20(s，3H)，3.54(s，1H)，3.17(s，3H)。

实施例三：化合物5的合成

称取化合物2和3各0.50g，加入到装有10ml甲醇的圆底烧瓶中，室温条件下搅拌后加入少量0.5mol/L碳酸氢钠水溶液，敞开搅拌约1小时。向反应后的溶液中加入4ml饱和KI溶液，搅拌约5分钟后抽滤，再用水洗，丙酮洗，最终得到砖红色固体，干燥过滤并浓缩后柱层析纯化，得0.98g化合物4，产率为81.7％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.77(d，J＝8.3Hz，1H)，8.18(d，J＝8.7Hz，1H)，8.02-7.96(m，2H)，7.74(d，J＝8.2Hz，2H)，7.59(t，J＝7.7Hz，1H)，7.39(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(s，1H)，6.85(s，1H)，4.07(s，3H)，3.98(s，3H)，2.87(s，3H)。

实施例四：化合物6a的合成

称取0.0756g(0.170mmol)的M₃于25ml的圆底烧瓶中，加入2倍摩尔量的4，4-二甲基氨基-苯甲醛0.0505g、溶剂正丁醇、4-甲基哌啶数滴，在120～150℃下反应3个小时，冷却后抽滤，用正丁醇和冰水配置的混合溶液洗涤固体，真空干燥称重后得72mg，产率73.4％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.70(d，J＝8.3Hz，1H)，8.13(d，J＝8.8Hz，1H)，8.03(d，J＝7.7Hz，1H)，7.97-7.92(m，1H)，7.79(d，J＝8.9Hz，2H)，7.71(d，J＝7.8Hz，1H)，7.69-7.64(m，2H)，7.63(s，1H)，7.56(t，J＝7.8Hz，1H)，7.43(d，J＝15.7Hz，1H)，7.36(t，J＝7.6Hz，1H)，6.79(d，J＝9.1Hz，3H)，4.13(s，3H)，3.94(s，3H)，3.05(s，6H)。

实施例五：化合物6b的合成

合成方法同6a，得70mg黑色固体6b，产率76.5％：¹H NMR：(400MHz，DMSO-d₆)δ12.00(s，1H)，8.72(d，J＝8.0H_Z，1H)，8.18(d，J＝16.0H_Z，3H)，8.00(m，3H)，7.69(m，3H)，7.58(d，J＝8.0H_Z，2H)，7.47(d，J＝12.0H_Z，1H)，7.35(t，J＝8.0H_Z，1H)，7.27(s，2H)，6.82(s，1H)，4.19(s，3H)，4.94(s，3H)。

实施例六：化合物6c的合成

合成方法同6a，得79mg紫色固体6c，产率83.5％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.70(d，J＝8.5Hz，1H)，8.12(d，J＝8.9Hz，1H)，8.07(d，J＝7.9Hz，1H)，7.95(t，J＝7.8Hz，1H)，7.73-7.68(m，2H)，7.59(dd，J＝13.5，7.0Hz，3H)，7.49(d，J＝8.7Hz，2H)，7.39(t，J＝7.6Hz，1H)，7.17(dd，J＝24.7，13.8Hz，3H)，6.83-6.76(m，3H)，4.09(d，J＝8.5Hz，3H)，3.96(s，3H)，3.00(d，J＝11.7Hz，6H)

实施例七：化合物6d的合成

合成方法同6a，得76mg红色固体6d，产率77.4％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.69(d，J＝8.4Hz，1H)，8.01(ddd，J＝13.8，10.1，7.4Hz，4H)，7.94-7.89(m，1H)，7.69(t，J＝7.4Hz，1H)，7.64(d，J＝4.5Hz，1H)，7.60(d，J＝9.5Hz，1H)，7.58-7.49(m，2H)，7.44(s，1H)，7.34(dd，J＝19.2，8.3Hz，3H)，6.79(s，1H)，4.07(s，3H)，3.92(s，3H).

实施例八：化合物6e的合成

合成方法同6a，得82mg褐色固体6e，产率85.6％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ9.10(s，1H)，8.77(s，1H)，8.66(d，J＝3.7Hz，1H)，8.39(d，J＝7.3Hz，1H)，8.17(s，1H)，8.06(d，J＝7.5Hz，1H)，7.99(s，1H)，7.91(d，J＝15.9Hz，1H)，7.74(s，2H)，7.67(d，J＝18.3Hz，1H)，7.65-7.52(m，3H)，7.41(s，1H)，6.91(s，1H)，4.16(s，3H)，4.00(s，3H).

实施例九：化合物6f的合成

合成方法同6a，得80mg紫黑色固体6e，产率83.2％：¹H NMR(400MHz，DMSO)δ8.73(t，J＝10.7Hz，1H)，8.10(dd，J＝18.2，9.6Hz，2H)，7.97-7.92(m，1H)，7.74-7.68(m，2H)，7.67-7.61(m，2H)，7.60-7.51(m，3H)，7.45(dd，J＝13.6，5.9Hz，2H)，7.42-7.35(m，3H)，7.31(d，J＝15.2Hz，2H)，6.83(d，J＝9.2Hz，1H)，4.06(d，J＝14.2Hz，3H)，3.97(d，J＝7.1Hz，3H).

实施例十：核酸选择性

DNA配置：DNA样品购自英骏生物技术有限公司。将DNA适量溶于Tris-HCl的缓冲液中(PH 7.4，100mM Tris，60mM KCl)或者Tris-醋酸缓冲中(PH 5.5，100mM Tris，60mM KCl)，超微量紫外定浓，在95℃下加热5min后缓慢冷却退火到室温作为储存液，4℃储存。

将5mM的化合物储备液稀释成5uM的浓度，再加入不同种类的核酸用荧光分光光度计(狭缝宽度＝10，扫描速度＝200，Ex＝475nm)测出其各自的荧光强度，发现这一系类化合物与G-四链体DNA的结合之后荧光强度最强.

DNA序列

实施例十一：检测限的测定

将5mM的化合物储备液稀释成5uM的浓度，再在荧光分光光度计(狭缝宽度＝10，扫描速度＝200，Ex＝475nm)扫描，再往其中慢慢加入Oxy28的DNA做到使其饱和.检测限的计算公式

LOD＝K×S_b/m

LOD(化合物的检测限)，m是浓度C与(F-F₀)/F₀的所做直线的斜率，S_b为用仪器空白多次测量的标准偏差，K值按照国际纯粹和应用化学联合会建议通常取为3，6a测得的LOD为0.87nM.

实施例十二：核酸凝胶电泳实验

先将5×TBE电泳缓冲液、过硫酸铵10％m/V、6X载样缓冲液、亚甲双丙酰胺(29∶1)(％，m/V)配好，接着安装电泳装置和配置凝胶溶液，灌制凝胶，待凝胶冷却之后取出梳子和隔板，放入电泳槽中，缓冲液淹没过胶1-2mm为止，DNA样品配成5μM(混合液中上样缓冲液为1×)，取10μL加入凝胶点样孔中，将整个电泳仪接通，45V电压跑1h，接着100V电压跑3h，取出凝胶块，再将凝胶块放入染色剂和化合物中泡染，染过之后吹干，将其置于凝胶电泳仪上观察.

实施例十三：细胞成像实验

先将细胞接种于6孔板中，使细胞的密度约为2×10³个/mL，然后在37℃、5％CO₂环境中培养24h。接着弃去上步6孔板中的细胞培养液，用预冷的1×PBS洗3次，然后再加入预冷的纯甲醇1.5mL常温避光放置1min，最后弃去纯甲醇并再用预冷的1×PBS洗3次，加入1mL的5μM的化合物然后放置15min。弃去上步6孔板中的化合物溶液，用预冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1μM的DAPI溶液1mL并37℃放置2min，然后再用预冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。在倒置荧光显微镜下观察细胞染色情况。