一种识别过氧化氢的荧光探针的制作方法

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种具有大斯托克斯位移检测过氧化氢的新型红光-近红外荧光探针的制备方法以及其在体外和活细胞内部检测过氧化氢方面的应用。

背景技术：

过氧化氢(h2o2)是最重要的活性氧(ros)之一，在许多生理和病理过程中起关键作用。过氧化氢(h2o2)可以通过在激素，细胞因子，神经递质和肽生长因子的细胞刺激期间通过nadph氧化酶复合物(nox)的活化在细胞中内源性产生。内源性过氧化氢(h2o2)不仅是作为生物系统的氧化应激指标的主要氧化代谢物，而且是调节许多生物过程如伤口愈合，免疫，细胞增殖，分化和迁移的重要信号分子。然而，过氧化氢(h2o2)的异常水平与许多疾病密切相关，包括神经退行性疾病，糖尿病，癌症和衰老。由于过氧化氢(h2o2)的影响很大，设计有效的方法定性和定量检测过氧化氢(h2o2)是有意义和必要的。目前，已经报道了多种具有高灵敏度检测过氧化氢(h2o2)的荧光探针。然而大部分这类探针发射波长短，具有小的斯托克斯位移(stokesshifts)的缺点。然而长得发射波长能够减少探针检测过程中对活细胞的光损伤，增强组织穿透性，大斯托克斯位移也能够减少自吸收提高检测的灵敏度。目前报道一种具有大斯托克斯位移，用于检测过氧化氢近红外荧光探针的还比较少。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种简便高效的荧光探针合成方法；本发明之另一目的是提供一种好选择性，强抗干扰能力，大斯托克斯位移(stokesshifts)，发射波长在近红外，能够对体外或者活细胞内部进行过氧化氢检测的荧光探针。

本发明解决问题采取的技术方案为，一种荧光开关(off-on)法识别过氧化氢新型荧光探针，其分子结构式如下：

合成路线如下：

具体合成方法如下：(a)将化合物1(234.0mg，1.0mmol)和碳酸钾(300.1mg，2.2mmol)溶于8.0ml丙酮中室温下搅拌10分钟。然后向混合物中加入2-(4-(溴甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(356.2mg，1.2mmol)，在70℃反应3h。冷却至室温后，将反应混合物减压除去溶剂，柱层析分离得到化合物2(197.2mg，43.7％)，为黄色固体。(b)在室温下将化合物2(90.3mg，0.2mmol)和氰基乙酸乙酯(48.2mg，0.4mmol)溶于5.0ml乙醇中的溶液中，加入哌啶(5.0μl，0.05mmol)。在室温下搅拌5分钟后，将所得溶液回流1小时。然后，将反应溶液减压浓缩，柱层析分离得红色固体的化合物3(46.0mg，39.4％产率)。

本发明的荧光探针的作用机理如下，探针分子本身荧光处于淬灭状态。过氧化氢能够氧化探针分子中芳香硼酸酯部分，水解得到酚羟基，然后分子内发生质子转移离去化合物4部分得到中间体5，最后发生亲核取代反应分子内环化得到化合物6。从而实现特异性检测过氧化氢(h2o2)的目的。探针分子的响应过程如下：

本发明的荧光探针在近红外发射，其与过氧化氢(h2o2)作用前无荧光，作用后荧光发射峰在619nm处。

本发明的荧光探针具有大斯托克斯位移(stokesshifts)，最大吸收在480nm，与过氧化氢(h2o2)作用后最大发射在619nm，斯托克斯位移(stokesshifts)为139nm。

本发明的荧光探针选择性好。探针分子的测试体系为ph为7.4的10mm的pbs缓冲溶液包含30％乙醇，室温下测量。探针分子本身没有荧光，在加入40倍当量过氧化氢(h2o2)之后，在最大发射波长619nm处荧光强度增大了22倍。而在加入其他活性氧物质及一些阴阳离子(roo^.，no^.，tbhp，clo^-，ko2，onoo^-，oh^-，i^-，f^-，po4^3-，no2-，no3^-，so3^2-，s2o3^2-，scn^-，cn^-，co3^2-，fe²⁺，fe³⁺)后，荧光只有几乎可以忽略的增加。

本发明的荧光探针抗干扰能力强，其他活性氧物质及一些阴阳离子(roo^.，no^.，tbhp，clo^-，ko2，onoo^-，oh^-，i^-，f^-，po4^3-，no2-，no3^-，so3^2-，s2o3^2-，scn^-，cn^-，co3^2-，fe²⁺，fe³⁺)的存在不影响探针分子与过氧化氢(h2o2)的作用。

本发明的荧光探针在加入40倍当量的过氧化氢(h2o2)作用后，荧光快速增强，在40分钟达到最大值，且可观察到荧光的明显变化。

本发明的荧光探针表现出较宽的应用范围，探针分子在ph为7至11的范围内都可以对过氧化氢(h2o2)选择性识别。

本发明所述的探针分子对过氧化氢(h2o2)响应后的发射波长在近红外，斯托克位移大，具有良好的选择性和抗干扰能力，并且具有好的灵敏度，具有较宽的应用范围，该荧光探针在生物与化学等领域具有实际的应用价值。

附图说明

图1为本发明荧光探针的选择性，荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％溶液中，与过氧化氢(h2o2)作用后的荧光光谱，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图2为本发明荧光探针的抗干扰能力，过氧化氢(h2o2)与其他氧化物及阴阳离子共存时，与荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中与过氧化氢(h2o2)作用后的荧光强度比值(i/i0)柱状图。

图3为本发明的荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中，与不同浓度过氧化氢(h2o2)作用后的荧光光谱变化，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为本发明的荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中，与过氧化氢(h2o2)浓度的线性关系，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图5为本发明的荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中，与过氧化氢(h2o2)作用过程中619nm处荧光强度随时间的变化，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图6为本发明的荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中，与过氧化氢(h2o2)作用过程中619nm处荧光强度随时间的线性关系，横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。

图7为本发明的荧光探针(10.0×10^-6mol/l)在不同ph值缓冲溶液中，与过氧化氢(h2o2)作用前后的荧光强度，横坐标为ph，纵坐标为荧光强度。

图8为本发明的荧光探针检测hela细胞内过氧化氢(h2o2)的活性应用，a1-a3为探针(10.0×10^-6mol/l)37℃时在细胞内培育30min的成像效果。b1-b3为细胞在37℃时先用过氧化氢(0.4×10^-3mol/l)培育30min，随后用探针(10.0×10^-6mol/l)培育30min的成像效果。

具体实施实例

实施例1：中间产物2的合成

将化合物1(234.0mg，1.0mmol)和碳酸钾(300.1mg，2.2mmol)在8.0ml丙酮中在室温下搅拌10分钟。然后向混合物中加入2-(4-(溴甲基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(356.2mg，1.2mmol)，将得到的混合物在70℃反应3h。反应结束后冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩，得到粗产物。最后，使用石油醚/二氯甲烷(5/1，v/v)作为洗脱液进行柱色谱，得到化合物3(197.2mg，43.7％)，为黄色固体。¹hnmr(500mhz，cdcl3)δh10.26(s，1h)，7.83(d，j＝7.7hz，2h)，7.45(d，j＝7.7hz，2h)，7.01(s，1h)，6.04，1.55(s，2h)，1.36(s，12h)，1.16(t,j＝7.0hz,3h),1.12(t,j＝7.1hz,3h)

实施例2：探针分子的合成

在室温下将化合物2(90.3mg，0.2mmol)和氰基乙酸乙酯(48.2mg，0.4mmol)溶于5.0ml乙醇，加入哌啶(5.0μl，0.05mmol)，在室温下搅拌5分钟后，将所得溶液回流1小时。反应结束后，将反应溶液减压浓缩，得到粗产物。最后，使用石油醚/乙酸乙酯(4/1，v/v)作为洗脱剂进行柱色谱，得到红色固体的probe1(46.0mg，39.4％产率)。hrms(esi)m/z：c22h21n6o5[m+1]+，449.1573；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δh8.72(s，1h)，7.82(d，j＝8.0hz，2h)，7.73(s，1h)7.42(d，j＝8.0hz，2h)，5.98(s，1h)，5.15(s，2h)，4.31(q，j＝7.1hz，2h)，3.31(m，8h)，1.35(t，j＝15.5,3h)，1.34(s，12h)，1.21(t，j＝7.0hz，3h)，1.07(t，j＝7.1hz，3h)。¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δc165.2，155.9，147.1，143.4，140.0，135.1，128.8，126.1，118.8，109.6，94.4，90.3，83.8，71.1，61.3，48.0，45.8，45.5，44.8，24.6，14.3，10.7，9.8。

实施例3：本发明的荧光探针的应用

将探针分子溶于pbs(10mm，ph＝7.4)/etoh30％中配制成10.0×10^-6mol/l的溶液，向溶液中加入各种活性氧物质及阴阳离子(roo.，no.，tbhp，clo^-，ko2，onoo^-，oh^-，i^-，f^-，po4^3-，no2-，no3^-，so3^2-，s2o3^2-，scn^-，cn^-，co3^2-，fe²⁺，fe³⁺)后没有引起荧光的明显变化，当过氧化氢(h2o2)与干扰物质(roo^.，no^.，tbhp，clo^-，ko2，onoo^-，oh^-，i^-，f^-，po4^3-，no2-，no3^-，so3^2-，s2o3^2-，scn^-，cn^-，co3^2-，fe²⁺，fe³⁺)共存时，探针不受干扰因素的影响，表现出来很强的抗干扰能力。该探针分子与过氧化氢(h2o2)响应在一定时间及浓度范围内都具良好的线性关系。探针分子在ph为7至11的范围内都可以对过氧化氢(h2o2)选择性识别，表现出了良好的生物适应能力。