一种基于多肽识别基团的荧光探针、其制备方法及其对铜离子与氰根离子的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学分析检测技术领域，具体为一种基于多肽识别基团的荧光探针、 其制备方法及其对铜离子与氰根离子的检测方法。
【背景技术】
[0002] 人类对于重金属的开采、冶炼、加工等日益剧增，电镀、冶金、化工等行业的不断发 展，使得环境(水、大气、土壤等）中金属离子(如Cu 2+)含量不断上升。同时Cu2+又是生物体内 的一种重要元素，具有多种重要的生理学功能，在生物体内参加正常的生物化学反应、新陈 代谢等。但摄入过量铜离子又会对人体机能造成损害。因此寻求快速有效的铜离子检测方 法不仅对环境监测而且对一些生理过程的研究都具有非常重大的意义。（[J]Linder， Μ·C·et al·Am.J·Clin.Nutr·1996，63，797·[J]Gaggelli，E·et al·Chem.Rev·2006，106， 1995·[J]Halloran，T.V.0.et al.J.Biol.Chem.2000,275,25057.[J]Sasaki，D.Y.et al.Angew.Chem.1995,107,994.[J]Torrado,A.et al.J.Am.Chem.Soc.1998,120,609.[J] Valentine,J.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,3617.[JjBrown,D.R.et al.Dalton Trans.2004,1907.[J]Barnham,K.J.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2004,3, 205.[J]Kim，B.E.et al.J.Nat.Chem.Biol.2008，4,176.)
[0003] 氰化物是一类剧毒化合物，其氰根离子能与细胞色素氧化酶中的铁离子结合，破 换该酶的活性进而影响呼吸功能。氰根离子能通过皮肤、肺及胃肠道被人体吸收从而导致 人意识丧失并可能导致死亡。根据世界卫生组织的规定，饮水中氰根离子的浓度不能超过 1.9um 〇l/L。另一方面，氰化物又有着广泛的工业应用，如金提炼、电镀、冶金、有机化学品生 产等领域。这又不可避免地造成了氰化物的排放。因此亟待寻求检测氰根离子的快速有效 方法D([J]Hamel J.et al.Crit.Care Nurse，2011，31，72.[J]Pramanik J.et al.ACS Appl.Mater.Interfaces,2014,6,5930.[J]Giuriati C.et al . Journal of Chromatography A,2004,1023,105.[J]Lv J.,et al.Forensic Science International, 2005,148,15.[J]Qian G.et al.J.Mater.Chem.,2009,19,522.)
[0004] 铜离子能与含氮、氧原子的特殊结构分子络合，且其d9的顺磁性结构对荧光有很 强的淬灭作用。因此把荧光骨架与能识别铜离子的基团以一定方式偶联便可得到"on-off" 型的铜离子荧光探针。另一方面，氰根离子能与铜离子形成稳定的络合物(Cu(CN) x),从而 可以使相应探针分子的荧光得到恢复。因此基于该原理可用于设计铜离子与氰根离子的双 重检测探针。
[0005] 但目前用于铜离子与氰根离子检测的该类荧光探针分子往往存在水溶性较差，不 利于实际应用等问题。而且大部分都是基于人工合成的识别基团，因此带来探针分子合成 繁琐以及生物相容性不好等问题。因此，研究设计具有水溶性和生物相容性好的、可用于铜 离子与氰根离子双重检测的荧光探针是非常必要的。
【发明内容】
[0006] 本发明所解决的技术问题在于提供一种基于多肽识别基团的荧光探针、其制备方 法及其对铜离子与氰根离子的检测方法，从而解决上述【背景技术】中的问题。
[0007] 本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
[0008] -种基于多肽识别基团的荧光探针，所述荧光探针的探针分子化合物结构通式如 下：
[0010] 上述结构通式中，Rl、R2各自独立选自具有1至8个碳原子的烷基链的的任一种，R3 选自氢、氯、溴、碘、羟基、甲氧基或乙氧基中的任一种。
[0011] 本发明中，作为一种优选的技术方案，所述荧光探针的探针分子化合物的结构式 为：
[0013] 所述荧光探针采用如下方法制备：
[0014] 将香豆素-3-羧酸骨架在良性有机溶剂中，加入羧基、氨基偶联试剂进行活化反 应，然后加入三肽物质反应，再向反应体系中加入不良溶剂使产物沉淀出来，将沉淀用高效 液相色谱分离得到探针分子化合物，
[0015] 所述香豆素-3-羧酸骨架结构通式如下：
[0017]本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述香豆素-3-羧酸骨架 的5位取代基(R3)选自氢、氯、溴、碘、羟基、甲氧基或乙氧基中的任一种，7位取代N的连接基 团(R1、R2)各自独立选自具有1至8个碳原子的烷基链的任一种。
[0018]本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述三肽物质由两个甘氨 酸与一个组氨酸组成，其结构如下所示：
[0020] 本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述良性有机溶剂选自 NMP、DMF或THF中的一种。
[0021] 本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述羧基、氨基偶联剂选 自01(：、00：、!10财、耶1'1]中的一种或两种。
[0022] 本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述不良溶剂选自乙醚、 甲醚或石油醚中的一种。
[0023]本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，反应温度为20_50°C，反应 时间为l_24h。
[0024]本发明中，作为一种优选的技术方案，上述制备方法中，所述香豆素-3-羧酸骨架 的浓度为Ι-lOmM，所述羧基、氨基偶联剂的浓度为Ι-lOmM，所述三肽物质的浓度为1-lOmM。
[0025]上述方法中反应流程如下：
[0027]其中Rl、R2各自独立选自具有1至8个碳原子的烷基链的的任一种，R3选自氢、氯、 溴、碘、羟基、甲氧基或乙氧基中的任一种。
[0028]作为优化的制备方法，步骤如下：
[0029] 将7-二乙胺基香豆素-3羧酸溶解于DMF中，加入DIC与HOBt进行活化，然后加入三 肽(Gly-Gly-His，GGH)进行偶联反应，再向反应体系中加入乙醚使产物沉淀出来，将沉淀用 高效液相色谱分离纯化得到探针分子化合物。反应流程如下：
[0031 ]作为进一步优化的制备方法，步骤如下：
[0032] (1)将7-二乙胺基香豆素-3羧酸溶解于DMF中，25°C的室温下搅拌溶解，然后加入 DIC和HOBt偶联试剂，继续搅拌活化反应Ih，用薄层色谱监测反应进程，待原料反应完毕生 成活化中间体；
[0033] (2)在上述溶液中缓慢滴加含有三肽Gly-Gly-His的DMF溶液，在2h时间内滴加完 毕，反应继续进行3h，用薄层色谱监测反应进程，待原料反应完毕，向反应溶液体系中加入 冰乙醚，-4°C下冷冻离心收集沉淀产物，用高效液相色谱分离得到纯的探针化合物；
[0034]其中，7-二乙胺基香豆素-3 羧酸用量 522mg(2mmol)，DIC 用量 252mg(2mmol)，H0Bt 用量270mg(2mmol)，三肽 Gly-Gly-His 用量538mg(2mmol)，DMF 量 20mL，乙醚用量 80mL。
[0035]本发明还公开了所述荧光探针在检测铜离子与氰根离子领域方面的应用。
[0036]其中，所述荧光探针用于水体以及生物体系中铜离子的检测。
[0037]其检测方法如下：
[0038]采用所述荧光探针检测铜离子时，探针分子溶解于纯水相体系的HEPES缓冲溶液 中，对铜离子进行检测。
[0039] 采用所述荧光探针检测铜离子时，所述荧光探针分子对铜离子的检测浓度为0.1_ l.Oymol · L-、检须顺为0·021μπιο1 · L-、
[0040] 所述荧光探针在纯水相体系的缓冲溶液中对氰根离子进行检测。
[0041 ]其检测方法如下：
[0042]采用所述荧光探针检测氰根离子时，首先将探针分子与铜离子原位配位结合，再 利用生成的络合物(C-GGH-Cu2+)对氰根离子进行定性和定量检测。
[0043] 即：先将合成的荧光探针分子（1 .Ομπιο? · L-4溶解于水体系的HEPES缓冲溶液中 (ρΗ=10.0)，加入等浓度的铜离子(Ι.Ομ mol · Γ1)混合得到探针分子-铜离子的络合物探针 溶液，再利用探针分子-铜离子的络合物探针溶液对氰根离子进行定性和定量检测。
[0044] 采用荧光检测氰根离子时，所述荧光探针分子体系的检测使用浓度为0.2-1.5μ mol · L-S检测限为0.017μηιο1 · L-、
[0045] 由于采用了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
[0046] 本发明的荧光探针分子使用纯水相缓冲体系溶液，室温下便可对铜离子与氰根离 子进行测试。加入铜离子时，由于Gly-Gly-His能对其进行识别，探针分子能与铜离子结合 形成络合物，使探针分子的荧光发生淬灭。当向探针分子与铜离子的络合物体系中加入氰 根离子时，氰根离子能结合铜离子形成Cu (CN) X络合物，从而探针分子的荧光得到恢复。
[0047] 本发明提供的荧光探针分子具有良好的水溶性、生物相容性、稳定性和光学性质。 与铜离子结合前，在470nm处有强荧光发射，呈现蓝光；随着铜离子的引入，探针分子在 470nm处荧光发射逐渐被淬灭，对应的蓝光消失。而向生成的不具有荧光发射的探针分子-铜离子络合体系中加入氰根离子，其在470nm处的荧光又得到逐渐恢复。
[0048] 本发明所述的探针分子原料易得，识别基团为纯天然多肽，合成产率高，水溶性、 生物相容性好，选择性与灵敏度高，对铜离子与氰根离子的识别能力强，响应迅速。对铜离 子的检测浓度范围为0.1_1.(^111 〇1.1/1，检测限为0.02以111〇1.1/1;对氰根离子的检测浓度 范围为0.2-15μηιο1 · I/1，检测限为0.017μηιο1 · L'因此该探针可用于水体和生物体系中 铜离子与氰根离子的检测。
【附图说明】
[0049]图1为本发明合成的探针分子的核磁共振氢谱。
[0050] 图2为本发明的Ι.Ομ mol · IZ1探针分子在加入不同浓度铜离子后的荧光光谱图，加 入的铜离子浓度分别为0·1、0·2、0·3、0·4、0·5、0·6、0·7