一种甲醛荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种甲醛荧光探针其制备方法和应用，属于甲醛探针的制备技术领 域。
【背景技术】
[0002] 甲醛是一种具有特殊刺激性气味的无色气体，被确认为具有强烈的致癌和促癌作 用，对人的眼睛、鼻、呼吸道和皮肤等易暴露器官产生伤害。目前，环境中甲醛主要来源于酚 醛及脲醛树脂、纺织品助剂和防腐剂等人类生产活动，以及某些有机化合物的代谢和降解。 甲醛也是人体内源性物质，可以通过氨基脲敏感胺氧化酶和赖氨酸特异性组蛋白去甲基化 酶1等生物酶催化产生。研究发现，甲醛对人的空间记忆和认知能力的形成起着重要作用。 然而，当血液中甲醛浓度超标时，会导致一些疾病的发生，比如癌症、神经组织退化、糖尿 病、老年痴呆症和慢性肝功能紊乱等。因此，发明一种能快速、方便检测生理环境中甲醛具 有重要的现实意义。
[0003] 目前，主要通过分光光度法、电化学检测法、气相色谱法、液相色谱法等检测手段 来检测甲醛。这些方法一般适用于检测水溶液、纺织品和食品中的甲醛，并不适于生物环境 的甲醛的检测，因为它们的检测灵敏度有限并且对生物样品具有破坏性。近年来，小分子有 机荧光探针受到科学界的广泛关注，它与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生变 化，以达到检测目的。利用荧光探针的荧光分析法具有特异选择性、高灵敏度、响应时间快 等特征，并且对细胞内目标分子进行非侵入性成像检测可以实时在线，形象具体地观察到 信号变化。所以，发明能快速检测、易观查信号变化的甲醛荧光探针是非常有必要的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种能快速检测甲醛的增强型荧光探针，简称探针II;并 进一步提供了探针II的制备方法和应用。
[0005] 技术方案 一种甲醛荧光探针，简称探针II，其结构式如下：
[0006] 本发明的甲醛荧光探针，对甲醛的响应时间为10秒左右。所述响应时间为:本发明 的甲醛荧光探针作用于含有甲醛的水溶液，采用荧光光谱仪观察荧光光谱峰值达到最大所 需时间。
[0007] 本发明的甲醛荧光探针，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、 丝氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、双氧水和次氯酸的干扰。特异性好。
[0008] 上述的甲醛荧光探针的合成路线如下：
化合物2即为探针II。
[0009] 上述的甲醛荧光探针的制备方法，包括如下步骤： 1) 将罗丹明6G溶解于甲醇中，随后加入乙二胺，加热至回流，搅拌反应6小时以上;然后 除去反应液中的甲醇得到化合物1; 2) 化合物1和四氢铝锂混合后用四氢呋喃溶解，然后在氮气保护、常温和搅拌条件下反 应10小时以上;然后加入乙醇、搅拌直到无气泡冒出，再加入水，之后用二氯甲烷萃取，收集 有机相;除去有机相中的水、四氢呋喃和二氯甲烷，得探针II。
[0010]上述制备方法，优选的， 乙二胺的加入方式为滴加； 采用旋转蒸发仪减压蒸馏除去反应液中的甲醇； 步骤2在使用化合物1之前，可以用硅胶层析柱进一步纯化； 乙醇的加入方式:在搅拌条件下缓慢滴加； 用无水硫酸钠去除有机相中的水； 用旋转蒸发仪除去有机相中的四氢呋喃和二氯甲烷； 所得探针II，可以用硅胶层析柱进一步纯化。
[0011] 步骤2中，加入乙醇的作用为消耗过量的四氢铝锂。
[0012] 本发明的上述甲醛焚光探针用于检测甲醛。包括用于检测水环境中的甲醛和生物 样品的甲醛。
[0013] 上述应用，具体的，包括： 观察加入探针II前后待测水环境的荧光光谱的变化;荧光激发波长为530 nm; 或者，用肉眼观察加入探针II前后待测水环境的颜色变化； 或者，在356 nm光源照射下，用肉眼观察加入探针II前后待测水环境的荧光变化； 或者，观察加入探针II前后待测生物环境的荧光成像图的变化。
[0014] 所述生物环境，可以是活细胞。
[0015] 所述荧光光谱的变化是指:荧光光谱中，560 nm处的荧光峰值的变化;如果峰值变 大，则说明含有甲醛。优选的，采用荧光光谱仪观察荧光光谱。
[0016] 所述颜色变化是指:含有甲醛的待测水环境加入探针II之后，其颜色变为红色。
[0017] 所述荧光变化是指:在356 nm光源照射下，荧光明显增强。
[0018] 所述荧光成像图的变化是指:从观察不到荧光到观察到红色荧光。优选的，采用共 聚焦显微镜。
[0019] 上述应用，具体的，包括以下步骤： (1) 将探针II溶于DMF，制成探针母液； (2) 将探针母液加入到待测液中； 用荧光光谱仪测试待测液的荧光光谱，在560nm处的荧光峰值的变化，如果峰值变大， 则说明含有甲醛;其中，荧光光谱仪激发波长为530 nm; 或者，用肉眼观察待测液的颜色变化，如果待测液由无色变成红色，则说明含有甲醛； 或者，在356 nm光源照射下，待测液的荧光增强，则说明含有甲醛； (3)将探针母液加入到生物样品中，用共聚焦显微镜，使用激发波长为514 nm的光源激 发，收集550-580 nm范围的荧光;观察到红色荧光，则说明含有甲醛。
[0020]首先，水溶液中的甲醛可以引起探针II的荧光光谱变化，因此，可以通过观察荧光 光谱仪中光谱的变化程度判断溶液中的甲醛含量，从而定量检测;其检测下限为7.7X HT7 mol/L。其次，随着探针II的加入，水溶液中的甲醛与探针II反应，从而使得含有甲醛的水溶 液的颜色发生变化；因此，能通过肉眼观察溶液的颜色变化而判断溶液中是否含有甲醛及 甲醛的大体浓度。再次，通过共聚焦显微镜对孵育了探针II和甲醛的活细胞进行荧光成像， 观察红色通道荧光信号的变化以达到比值检测生物环境中的甲醛的目的。另外，利用本发 明的探针II，采用荧光光谱仪测试水溶液的甲醛时，在10秒钟左右荧光光谱的峰值达到最 大;具备反应时间短的优势，实现了快速检测。
[0021 ]本发明的优点：（1)探针II的合成简单，并且产率较高；（2)本发明实现了水溶液中 甲醛的特异性和快速检测；（3)本发明实现了活细胞水平中甲醛的检测。
【附图说明】
[0022]图1是实施例1中化合物1的1H NMR图谱； 图2是实施例1中化合物1的13C NMR图谱； 图3是实施例1中探针II的1H NMR图谱； 图4是实施例1中探针II的13C NMR图谱； 图5是实施例2中探针II随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化情况；图中，从下至上，甲 醛浓度依次为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20以111〇1/1的荧光光谱； 图6是肉眼观察到探针11(10以111〇1/1)在?83缓冲溶液(浓度25 111111〇1/14!17.4，含50% DMiO与2当量甲醛在自然光(上)和便携式紫外灯365 nm光源照射(下)条件下的变化； 图7是实施例3中探针II与2当量甲醛在2min内，560 nm处荧光强度值随时间变化的变 化图； 图8是实施例4中探针II对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，1，空白；2， 甲醛;3,乙醛;4,乙二醛;5,甲基乙二醛;6,苯甲醛;7,丝氨酸;8,丙氨酸;9,甘氨酸；10,精氨 酸;11，葡萄糖;12，半胱氨酸;13，谷胱甘肽;14，双氧水;15，次氯酸； 图9是实施例5中探针II与HeLa细胞中甲醛响应的荧光成像图；图中，（a-c)是加入5 μΜ 探针II孵育30分钟后的荧光成像，（d-f)是随后加入10 ymol/L甲醛继续培育20分钟后的 荧光成像；（a，d)，明场成像；（b，e)，红色通道荧光成像；（c，f)，明场与红色通道荧光成 像图的置加图；激发波长为514 nm，标尺为20微米。 【具体实施方式】 [0023] 实施例1 化合物1的合成：
将480 mg罗丹明6G (分子式为:C28H31N2〇3Cl)(1.0 mmol)溶解于甲醇中，随后滴加300 mg乙二胺(5.0 mmol)，将反应液加热至70 °C左右，有物质开始回流后保持恒温，搅拌反应6 小时，反应完毕。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压蒸馏将溶剂（甲醇）除去得到粗产品。以 体积比为3:1的二氯甲烷与乙醇为洗脱剂，用硅胶(200-300目）层析柱进行纯化，得到342mg 白色固体(产率为 75 %)。咕 NMR (400 MHz, CDCl3)，（ppm): 1.31-1.34 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 1.90 (s, 6H), 2.33-2.35 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.17-3.24 (m, 4H), 3.52 (3Η), 6.22 (s, 2Η), 6.34 (s, 2Η), 7.05-7.07 (1Η), 7.43-7.49 (m, 2Η), 7.92- 7.94 (1H); 13C 匪R (100 MHz, CDCl3): δ (ppm): 14.72，16.71，38.34，40.69， 43.57, 65.13, 96.51, 105.95, 118.05, 122.80, 123.84, 128.10, 128.25, 131.08, 132.55, 147.47, 151.67, 153.52, 168.75. 探针II的合成： 取50 mg化合物1(0.1 mmol)和50 mg四氢错锂
（1.3 mmol)置于圆底烧瓶中，加入3 mL 四氢呋喃(溶剂)使反应物完全溶解，在氮气保护和常温下搅