一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光分子探针技术领域，尤其涉及一种黄酮基荧光分子探针及其制备 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 铜离子是人体不可缺少的微量元素之一，是生物体新陈代谢中极其重要的催化辅 因子，同时对基因表达、蛋白质折叠、神经系统功能化等生化进程起到关键作用。然而，人体 中铜离子的含量也有严格的标准，过多过少都会对人体的各项机能造成危害。人体内铜离 子失调与许多疾病密切关联，例如曼克氏症、阿森海默氏症、威尔逊氏症、肠胃功能紊乱、以 及肾脏疾病。随着人类工业化进程的快速推进，铜作为一种极其重要的工业原料被广泛的 使用，然而，由铜离子引起的环境的污染问题也日益突出。据报道，水中含铜量达到0.002 mg/L就会对鱼类产生毒性。铜离子引起的水污染不仅破坏环境，更会严重危害人类及其他 动植物的健康，因此开发优良的铜离子探针具有重要意义。
[0003] 迄今为止，人们已提出了多种铜离子检测方法，如电感耦合等离子体原子发射光 谱法、原子吸收光谱、电化学方法等。然而，这些方法大多需要复杂的电器仪表，繁琐的样品 制备过程，并且极易受样品背景(杂质、浮游生物、其它金属离子等)干扰。
[0004] 因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0005] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄酮基荧光分子探针及其 制备方法与应用，旨在解决现有铜离子检测方法需要复杂的电器仪表，繁琐的样品制备过 程，并且极易受样品背景干扰的问题。
[0006] 本发明的技术方案如下： 一种黄酮基荧光分子探针，其中，具有如下通式I所示的结构：
其中：Ri 为 H或 CH3; R2 为 CH3，OfcCH3 或(CH2) 3CH3。
[0007] -种如上所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，包括步骤： (1)、将摩尔比为1:1~1:3的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入乙醇 中，然后滴加入10~50毫升的氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌10~48小时；将反应液冷 却，缓慢滴加 IO~30毫升的双氧水溶液，室温搅拌3~IO小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干 燥，获得中间体A; (2) 、按摩尔比为1:3~1:10加入中间体A和碳酸钾，再加入10~20毫升的丙酮溶液，在冰 水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1~1:3，室温搅拌10~48小时，加入 30~60毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B; (3) 、将10~30毫摩尔中间体B溶解入甲醇中，加入20~50毫升的盐酸，50~80°C下加热4~ 10小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物重结晶，得到中间体C; (4) 、按1: 5~1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含R1取代基的溴甲基吡啶，再依 次加入摩尔比为10:1~3:1碳酸钾和碘化钾，最后加入10~30毫升的干燥DMF，反应在60~100 °C下搅拌10~48小时，待反应结束后，反应液经析出、萃取、洗涤、干燥得到粗产物，经柱色谱 分离得到通式I的化合物。
[0008] 所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤（1)中，所述对丙酰胺基 临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛的摩尔比为1:1。
[0009] 所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤(2)中，中间体A、碳酸钾 和硫酸甲酯的摩尔比为1:3:3。
[0010] 所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤(3)中，中间体B的摩尔量 为10毫摩尔，盐酸的加入量为20毫升，加热时间为4个小时。
[0011] 所述的黄酮基荧光分子探针的制备方法，其中，所述步骤(4)中，中间体C、含心取 代基的溴甲基吡啶、碳酸钾和碘化钾的摩尔比为1:10:10:1。
[0012] -种如上所述的黄酮基荧光分子探针的应用，其中，将所述黄酮基荧光分子探针 用于检测活细胞中游离铜离子。
[0013]有益效果：与传统方法相比，本发明的黄酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方 便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可以对重金属污染水源进行分析，也可以 在生物体系中得到应用。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的紫外可见吸收光谱图。
[0015] 图2为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的铜离子滴定示意图。
[0016] 图3为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL的离子选择性示意图。
[0017]图4为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL对人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)的毒性 实验结果图。
[0018] 图5a~5d为本发明实施例1中黄酮染料DPA-FL对活的人类脐静脉内皮细胞中的游 离铜离子的荧光成像结果图。
【具体实施方式】
[0019] 本发明提供一种黄酮基荧光分子探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、 技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的 具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020] 本发明提供一种黄酮基荧光分子探针，其中，具有如下通式I所示的结构：
其中：Ri为H或CH3; R2为CH3，CH2CH3或(CH2) 3CH3。其中，上述通式I所示的结构中包含如下 所示的啦啶配体单元Π 和黄酮基发光单元III。
[0022] 吡啶配体单元II为含吡啶的配体结构，其能够选择性的与酮离子配合;黄酮基发 光单元III由黄酮染料构成，其荧光光谱具有较大的斯托克斯位移，而且具有很低的细胞毒 性和良好的细胞相容性，是黄酮基荧光分子探针的发光单元。与传统方法相比，本发明的黄 酮染料的黄酮基荧光分子探针是一个方便、快捷、高灵敏度与高选择性的检测方式，不仅可 以对重金属污染水源进行分析，也可以在生物体系中得到应用。
[0023] 基于上述黄酮基荧光分子探针，本发明提供一种如上所述的黄酮基荧光分子探针 的制备方法，其包括步骤： (1)、将摩尔比为1:1~1:3的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入乙醇 中，然后滴加入10~50毫升的氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌10~48小时；将反应液冷 却，缓慢滴加10~30毫升的双氧水溶液，室温搅拌3~10小时，用稀盐酸中和，将沉淀过滤干 燥，获得中间体A;
优选地，所述步骤(1)中，所述对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含此取代基的苯甲醛的摩尔 比为1: 1。
[0024] 例如，将摩尔比为1:1的对丙酰胺基临羟基苯乙酮和含R2取代基的苯甲醛加入 50mL乙醇中，然后滴加入20毫升的质量分数为30%氢氧化钠溶液，滴加完毕后室温搅拌48小 时;将反应液用冷却水冷却，缓慢滴加20毫升质量分数为30%双氧水溶液，室温搅拌10小时， 用稀盐酸中和，将沉淀过滤干燥，获得中间体A。
[0025] (2)、按摩尔比为1:3~1:10加入中间体A和碳酸钾，再加入10~20毫升的丙酮溶液， 在冰水浴下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1~1:3，室温搅拌10~48小时， 加入30~60毫升的水淬灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B;
优选地，所述步骤(2)中，中间体A、碳酸钾和硫酸甲酯的摩尔比为1:3:3。
[0026]例如，按摩尔比为1:3加入中间体A和碳酸钾，再加入20毫升的丙酮溶液，在冰水浴 下，滴入硫酸甲酯，硫酸甲酯与碳酸钾的摩尔比为1:1，室温搅拌48小时，加入50毫升的水淬 灭反应，经过萃取，干燥和柱色谱分离，得到中间体B。
[0027] (3)、将10~30毫摩尔中间体B溶解入甲醇中，加入20~50毫升的盐酸，50~80°C下加 热4~10小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物重结晶，得到中间体C;
优选地，所述步骤(3)中，中间体B的摩尔量为10毫摩尔，盐酸的加入量为20毫升，加热 时间为4小时。
[0028] 例如，将10毫摩尔中间体B溶解入10毫升甲醇中，加入20毫升的盐酸，70°C下加热4 小时，冷却，中和，置于室温中，收集得到沉淀物，沉淀物在乙醇中重结晶，得到中间体C。
[0029] (4)、按1: 5~1:10的摩尔比向反应瓶中加入中间体C和含心取代基的溴甲基吡啶， 再依次加入摩尔比为10:1~3:1碳酸钾和碘化钾，最