专利名称：一种工业废水降解微生物菌株的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌株的培养方法，具体地说涉及一种工业废水降解微生物 菌株的培养方法；属于生物技术领域。
背景技术：
工业废水污染是治理当前生态保护中一项非常重要和极具挑战性的工作。来自 印染、制药、农药、制革、石油化工和食品工业等生产过程中的有机废水成分复杂、可生化性 差，严重污染水环境，甚至将削弱水生生物等的长期繁殖能力。现有的工业废水的净化处理 技术可归纳为生物法、化学法、物理_化学耦合法和物化_生物耦合法等。其中生物法具有 经济性好，无二次污染等优点。 现有的工业废水中对环境污染严重的主要有苯酚、苯胺和硝基苯类化合物等。其 中苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、纺织等工业废水中的主要污染物。硝基苯类化合物广泛应 用于农药、染料、炸药、橡胶以及其它化工产品的生产。环境中的硝基苯类污染物主要包括 硝基苯、硝基氯苯、硝基甲苯、硝基苯酚、硝基苯胺等化合物。利用微生物降解苯酚、苯胺和 硝基苯类化合物是一种既经济且不会产生二次污染的方法，近年来，从工业废水污染的环
境中分离到许多可以降解苯酚、苯胺和硝基苯类化合物的微生物菌株。盛连喜等人在应用 生态学报，2007年7月，第18巻，第7期中对硝基苯类化合物微生物降解研究进展，并从硝 基苯类化合物降解菌的驯化筛选，降解途径、降解激励、共代谢、趋化性和分子遗传学角度， 阐述了硝基苯类化合物生物降解的最近研究进展。温洪宇等人在徐州师范大学学报(自然 科学版)2003年12月，第21巻，第4期中叙述了降解苯酚细菌的分离及生理学特性研究， 虽然它通过菌株培养、驯化与筛选从工业废水中分离出两株可以降解苯酚的细菌，但是该 菌株仅仅对苯酚具有降解作用，对工业废水中同时具有苯胺和硝基苯类化合物的复合污染 物却不具有降解能力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的缺陷，提供一种对复合污染物具有降解能力的工业废 水降解微生物菌株的培养方法。 本发明的目的是通过下列技术方案来实现的一种工业废水降解微生物菌株的培 养方法，该方法包括以下步骤 A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含不同浓度梯度的 目标化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源，苯酚另 外添加氮源，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将 部分液体培养基转化成选择性固体培养基； B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然后接 种到含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度为15-45°C ，培养 时间6-25天，反复驯化培养2-12次，将驯化培养的菌株用选择性固体培养基进行平板划线分离，并进行质粒抽提，获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一 碳源的含质粒菌株； C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感 受态细胞，将步骤B中得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在 温度为10-4(TC的条件下孵育10-45小时；再加入到含不同浓度梯度的三种目标化合物的 液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45t:，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养 2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-4(TC的条件下孵育10-45小 时，然后进行质粒及降解能力鉴定； D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。 本发明针对废水中污染物的种类，采用含不同污染物种类的液体培养基对活性污
泥微生物进行驯化培养，再采用平板分离法获取可以污染物为唯一碳源、氮源和能源的含
质粒细菌。再加入感受态的宿主菌，采用不同浓度的废水进行驯化，促进质粒转移，并选择
优势菌种，纯化后最终得到具有复合污染物降解能力的含质粒的微生物菌种。 其中步骤A中配制不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基，主要配制目标化合
物的浓度为0， 0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L。不同浓度梯度的目
标化合物的液体培养基可以统计出工业废水降解微生物菌株随目标化合物浓度变化的生
长变化情况以及对目标化合物的降解率；微生物菌种生长所需要的其它化学基质成分主要
有磷、铁、钾、氧、钠、氯、钙、镁等元素。将部分液体培养基添加15-20g琼脂(按1000ml水
计算)后就转化成选择性固体培养基。 步骤B中采用的是常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基，培养基的配方为牛肉膏3克， 蛋白胨10克，氯化钠5克，琼脂15克，水1000ml。采用分子生物学方法进行质粒抽提，主要 通过离心集菌、碱裂解、酚抽提或氯化铯加溴化乙锭离心后用乙醇沉淀得到以苯胺或硝基 苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株。 步骤C中的假单胞菌株(Pseudomonas)主要是恶臭假单胞菌株，将它接种到 常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞悬浮在P朋.O的100mmo1/ L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。然后将细菌浓度为 1 X 107-3 X 109cfu/mL的三种含质粒菌株及细菌浓度为1 X 107_3 X 109cfu/mL的感受态细胞 重悬于LB液体培养基中，其中LB液体培养基用来预培养菌种，使菌种成倍扩增，达到使用 要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌。LB液体培 养基的配方如下胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L ;酵母提取物(Yeast extract) 5g/L ;氯化钠 (NaCl) 10g/L ;用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7. 4。
步骤D中采用划线平板分离法对获得菌株进行纯化。 在上述的工业废水降解微生物菌株的培养方法中，步骤A中所述的苯酚液体培养 基中的氮源为浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵或浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨中的一种。 在苯酚液体培养基中加入浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵或浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨 作为氮源可以提高菌株对苯酚的降解效率，其中加入浓度为500mg-1500mg/L蛋白胨降解 效率高于加入浓度为500mg-1500mg/L硝酸铵。 在上述的工业废水降解微生物菌株的培养方法中，步骤A中所述的液体培养基中 其它化学基质组分为硝酸钾0. 5-1. 5g/L ;氯化钠0. 1-lg/L ;K2HP04 3H20 :0. 2g_0. 8g/L ;MgS04 7H20 :0. 2g-0. 8g/L ;FeS04 7H20 0. 005—0. 015g/L。 作为优选，步骤B中驯化培养的培养温度为20-4(TC，培养时间7-21天，反复驯化 培养3-10次。 作为优选，步骤C中在LB液体培养基中孵育温度为15-35t:，孵育时间为12_36小 时。 作为优选，步骤C中驯化培养的培养温度为20-4(TC，培养时间7-21天，反复驯化 培养3-10次。 作为优选，步骤C中菌株涂布于选择性固体培养基孵育温度为15-35t:，孵育时间 为12-36小时。 综上所述，本发明具有以下优点 1、本发明的培养方法获得的菌株对复合污染物具有降解能力，应用比较方便且范 围较广，便于进行大规模的工业化推广。 2、本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对工业废 水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。
图1是实施例1培养的工业废水降解微生物菌株生长曲线图。 图2是实施例1培养的工业废水降解微生物菌株与pH值对应关系图。 图3是实施例1培养的工业废水降解微生物菌株对有机物的耐受性曲线图。 图4是实施例1培养的工业废水降解微生物菌株对工业废水中有机物的降解的曲线图。 图5是实施例2培养的工业废水降解微生物菌株生长曲线图。 图6是实施例2培养的工业废水降解微生物菌株与pH值对应关系图。 图7是实施例2培养的工业废水降解微生物菌株对有机物的耐受性曲线图。 图8是实施例2培养的工业废水降解微生物菌株对工业废水中有机物的降解的曲线图。
具体实施例方式
下面通过具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明；但
是本发明并不限于这些实施例。
实施例1 针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含浓度为Og/L，0. 5g/ L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓度梯度的目标化合物苯胺、苯酚 和硝基苯类化合物液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源，苯 酚另外添加氮源蛋白胨1000mg/L，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其 它化学基质配方硝酸钾0. 5g/L ;氯化钠:lg/L ;K2HP04 3H20 :0. 8g/L ;MgS04 7H20 :0. 2g/ L ;FeS04 7H20 0. 010g/L，并将部分液体培养基加入添加15g琼脂(按1000ml水计算)后 转化成选择性固体培养基。 将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然
5后接种到含浓度为0g/L， 0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓 度梯度的目标化合物苯胺、苯酚和硝基苯类化合物液体培养基进行驯化培养，培养温度为 20°C ，培养时间21天，反复驯化培养3次，将驯化培养的菌株涂布于选择性固体培养基进行 平板划线分离，并采用分子生物学方法进行质粒抽提，主要通过离心集菌、碱裂解、酚抽提 或氯化铯加溴化乙锭离心后用乙醇沉淀得到以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以 苯酚为唯一碳源的含质粒菌株。 将假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞 悬浮在P朋.O的10Ommol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。 将上述得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为15t:的 条件下孵育36小时；再加入到含含浓度为Og/L，0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L，2. 0g/L，2. 5g/L， 3. 0g/L，3. 5g/L不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温 度为2(TC，驯化培养时间21天，反复驯化培养3次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基， 在温度为15°C的条件下孵育36小时，挑选单菌落采用常规的方法进行质粒鉴定，并对其 随苯胺浓度的生长变化情况，随废水浓度的生长变化情况，降解能力鉴定；分别对其生长性 能，对pH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能进行鉴 定，鉴定结果如图1、图2、图3和图4所示。 将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得含质
粒的工业废水降解微生物菌株。 实施例2 针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含浓度为Og/L，0. 5g/ L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓度梯度的目标化合物苯胺、苯酚 和硝基苯类化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源， 苯酚另外添加氮源硝酸铵1000mg/L，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要 的其它化学基质配方硝酸钾1. Og/L ;氯化钠0. 5g/L ;K2HP04 3H20 :0. 5g/L ;MgS04 7H20 : 0. 5g/L ;FeS04 7H20 0. 005g/L，并将部分液体培养基加入添加20g琼脂(按1000ml水计 算)后转化成选择性固体培养基。 将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然 后接种到含浓度为Og/L， 0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓 度梯度的目标化合物苯胺、苯酚和硝基苯类化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度 为30°C ，培养时间14天，反复驯化培养6次，将驯化培养的菌株涂布于选择性固体培养基进 行平板划线分离，并采用分子生物学方法进行质粒抽提，主要通过离心集菌、碱裂解、酚抽 提或氯化铯加溴化乙锭离心后用乙醇沉淀得到以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源， 以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株。 将假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞 悬浮在P朋.O的lOOmmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。 将上述得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为25t:的 条件下孵育24小时；再加入到含含浓度为Og/L，0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L，2. 0g/L，2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温 度为3(TC，驯化培养时间14天，反复驯化培养6次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，5/5页
在温度为25t:的条件下孵育24小时，挑选单菌落采用常规的方法进行质粒鉴定，分别对其 生长性能，对PH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能 进行鉴定，鉴定结果如图5、图6、图7和图8所示。 将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得含质
粒的工业废水降解微生物菌株。 实施例3 针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含浓度为0g/L，0. 5g/ L， 1. 0g/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓度梯度的目标化合物苯胺、苯酚 和硝基苯类化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源， 苯酚另外添加氮源蛋白胨1000mg/L，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要 的其它化学基质配方硝酸钾1. 5g/L ;氯化钠0. lg/L ;K2HP04 3H20 :0. 2g/L ;MgS04 7H20 : 0. 8g/L ;FeS04 7H20 0. 015g/L，并将部分液体培养基加入添加20g琼脂(按1000ml水计 算)后转化成选择性固体培养基。 将工业废水中的活性污泥加入到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然 后接种到含浓度为Og/L， 0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L， 2. Og/L， 2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓 度梯度的目标化合物苯胺、苯酚和硝基苯类化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度 为4(TC，培养时间7天，反复驯化培养8次，将驯化培养的菌株涂布于选择性固体培养基进 行平板划线分离，并采用分子生物学方法进行质粒抽提，主要通过离心集菌、碱裂解、酚抽 提或氯化铯加溴化乙锭离心后用乙醇沉淀得到以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源， 以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株。 将假单胞菌株接种到常规的牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后把细胞 悬浮在P朋.O的lOOmmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，让其转化成感受态细胞。 将上述得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为35t:的 条件下孵育12小时；再加入到含含浓度为Og/L，0. 5g/L， 1. Og/L， 1. 5g/L，2. 0g/L，2. 5g/L， 3. Og/L， 3. 5g/L不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温 度为40°C ，驯化培养时间7天，反复驯化培养8次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在 温度为35t:的条件下孵育12小时，挑选单菌落采用常规的方法进行质粒鉴定，分别对其生 长性能，对pH值的适应性能，对废水中的有机物耐受性能和对废水中有机物的降解性能进 行鉴定。 将上述经过鉴定后符合标准的菌株采用划线平板分离法进行纯化后，即获得含质 粒的工业废水降解微生物菌株。 本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领
域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替
代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。 尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练
技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
权利要求
一种工业废水降解微生物菌株的培养方法，该方法包括以下步骤A、针对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物，分别配制含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基，其中苯胺和硝基苯类化合物以其为唯一的碳源和氮源，苯酚另外添加氮源，所述的液体培养基中还添加微生物菌株生长所需要的其它化学基质成分，将部分液体培养基转化成选择性固体培养基；B、将工业废水中的活性污泥加入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，然后接种到含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基进行驯化培养，培养温度为15-45℃，培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，将驯化培养的菌株涂布于选择性固体培养基进行平板划线分离，并进行质粒抽提，获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株；C、将假单胞菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中进行富集，富集后将其制成感受态细胞，将步骤B中得到的三种质粒菌株和所述的感受态细胞重悬于LB液体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时；再加入到含不同浓度梯度的三种目标化合物的液体培养基进行驯化培养，驯化培养温度为15-45℃，驯化培养时间6-25天，反复驯化培养2-12次，驯化培养后涂布于选择性固体培养基，在温度为10-40℃的条件下孵育10-45小时，然后进行质粒及降解能力鉴定；D、将步骤C中获得菌株进行纯化后，即获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。
2. 根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于步 骤A中所述的苯酚液体培养基中的氮源为浓度为500mg-l500mg/L硝酸铵或浓度为 500mg-1500mg/L蛋白胨中的一种。
3. 根据权利要求1或2所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于步骤A中所述的液体培养基中其它化学基质组分为硝酸钾0. 5-1. 5g/L ;氯化钠0. l_lg/L ;K2HP04 3H20 :0. 2g-0. 8g/L ;MgS04 7H20 :0. 2g_0. 8g/L ;FeS04 7H200. 005—0. 015g/L。
4. 根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于步骤B 中驯化培养的培养温度为20-4(TC，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
5. 根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于步骤C 中在LB液体培养基中孵育温度为15-35t:，孵育时间为12-36小时。
6. 根据权利要求1所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于步骤C 中驯化培养的培养温度为20-4(TC，培养时间7-21天，反复驯化培养3-10次。
7. 根据权利要求1或5或6所述的工业废水降解微生物菌株的培养方法，其特征在于 步骤C中菌株涂布于选择性固体培养基孵育温度为15-35t:，孵育时间为12-36小时。
全文摘要
本发明提供了一种工业废水降解微生物菌株的培养方法，属于生物技术领域。它解决了现有的用于降解工业废水的菌株降解作用单一，对复合污染物不具降解能力的问题。本工业废水降解微生物菌株的培养方法，包括以下步骤配制含不同浓度梯度的目标化合物的液体培养基；获取分别以苯胺或硝基苯化合物为唯一碳源和氮源，以苯酚为唯一碳源的含质粒菌株；驯化培养和进行质粒及降解能力鉴定；纯化获得含质粒的工业废水降解微生物菌株。本发明的培养方法工艺流程简单，使用原料的成本较低，培养的菌株对复合污染物具有降解能力，对工业废水中的苯胺、苯酚和硝基苯类化合物降解效率较高。
文档编号C02F101/36GK101701189SQ20091022375
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月19日 优先权日2009年11月19日
发明者李钧敏 申请人:李钧敏