专利名称：里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及镉污染农田土壤的修复方法，具体涉及里氏木霉FSio-C联合伴矿景天在农田镉污染土壤修复中的应用。
背景技术：
镉(Cd)是生物毒性最强的重金属元素之一。近年来，由于工业“三废”的排放，以及不合理的农业管理措施，导致土壤Cd污染日益严重，影响植物的生长，造成农作物产量和品质下降。因此，Cd污染土壤的治理与修复越来越引起全球范围内的高度重视。目前，在Cd污染土壤的众多治理方法中，超积累植物提取土壤中Cd是最具良好生态效应的土壤修复改良方法，其中伴矿景天是镉的超积累植物。为进一步提高植物修复效率，采用微生物与植物联合修复的手段，提高超积累植物对Cd污染土壤的修复效率成为Cd污染土壤生物修复发展的新趋势。木霉属(Trichoderma)作为一种优良的微生物资源,不仅对植物病原真菌具有拮抗效应，还能促进植物种子萌发、植株生长，提高作物产量。因此，本发明利用重金属污染土壤中筛选获得了里氏木霉(Trichoderma reesei)FS10_C,研发镉污染农田土壤的木霉强化植物修复方法，为Cd污染土壤的生物修复提供技术支撑。发明内容
解决的技术问题:本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供了一种里氏木霉FSlO-C联合伴矿景天在农田镉污染土壤修复中的应用。为进一步强化伴矿景天对镉污染土壤的修复效果，寻找一种微生物与伴矿景天联合修复的方式，提高伴矿景天对镉的提取效率，以期尽快恢复农田土壤的生产能力。
技术方案:保藏编号为CGMCC N0.3970 的里氏木霉(Trichoderma reesei) FS10-C联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用。该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2010年07月01日，保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC N0.3970。
应用实施步骤为:将株高约IOcm的伴矿景天幼苗扦插到待修复土壤中，在植株根际施加里氏木霉FSlO-C发酵液或微生物制剂，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的70%wt，植物生长60 150天后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。
发酵液的施加方式为:a.在移栽伴矿景天幼苗时，先将制备好的发酵液以鲜土重10%的施加量，分别在培养90d和130d时向植物根际部位追加一次木霉发酵液；b.将伴矿景天幼苗放入穴中；c.将土压紧实。
微生物制剂的施加方式为:在移栽伴矿景天幼苗后，将制备好的木霉微生物制剂以鲜土重4%的施加量撒到土壤表面。
有益效果:(I)里氏木霉FSlO-C联合伴矿景天处理污染土壤，显著提高了镉污染农田土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进处理效果的现象；(2)木霉发酵液和固体制剂施用方法简单，同时可以提高土壤微生物生物量，改善土壤的微生态环境；(3)环境友好，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。
图1镉污染水平下伴矿景天地上部镉浓度；
图2镉胁迫对里氏木霉FSlO-C生长的影响；
图3液体培养下镉对里氏木霉FSlO-C生长抑制率；
图4不同镉胁迫对里氏木霉FSlO-C形态的影响；
图5里氏木霉FSlO-C发酵液对伴矿景天地上部Cd浓度的影响；
图6里氏木霉FSlO-C发酵液对伴矿景天地上部Cd积累量的影响；
图7里氏木霉FSlO-C对修复后土壤中微生物生物量碳的影响；
图8里氏木霉FSlO-C制剂对伴矿景天地上部镉含量的影响；
图9里氏木霉FSlO-C对伴矿景天地上部镉提取修复效率的影响；
图10里氏木霉FSlO-C对修复后土壤中微生物生物量碳的影响。
具体实施方式
以下结合实例对本发明作进一步的描述:
实施例1:木霉发酵液对伴矿景天修复镉污染土壤的处理
I材料与方法
1.1 供试土壤
采自南京栖霞山清洁的铁质湿润淋溶土(黄棕壤)，其基本理化性质为:pH5.38(H2O),有机质 21.3g/kg,碱解氮 162.3mg/kg,速效磷 11.7mg/kg,速效钾 82.2mg/kg,阳离子交换量16.5cmol/kg,总镉含量0.05mg/kg。土壤样品自然风干后过2mm筛，以供盆栽模拟试验用。
1.2供试植物
伴矿景天苗，为实验室自行培育的幼苗。
1.3供试菌种
里氏木霉(Trichodermareesei )菌株 FS10-C (保藏编号:CGMCC N0.3970),菌丝白色棉絮状，绿色孢子、产黄色素。
1.4培养基
斜面培养基:采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)j# 200g马铃薯洗净切块，加去离子水煮沸30min后，过滤出上清液，向其中加20g葡萄糖、18g琼脂，用去离子水溶解至IOOOmL, 121°C灭菌 20min。
液体培养基:采用马铃薯葡萄糖培养基，组成同上，不加琼脂。
1.5木霉发酵液制备
将里氏木霉FSlO-C菌种在PDA斜面上进行活化，约7d后产孢子，用无菌水将孢子洗下后接种于PDA液体培养基中，于28°C、150 180r/min的恒温摇床上培养7d，即为木霉发酵液，混匀后待用。
1.6盆栽试验实施
本试验涉及的土壤Cd污染水平3个:0、5、15mg/kg Cd，分别接种木霉发酵液，同时以灭活发酵液为对照，共6个处理，重复3次。将上述过筛后的土壤分别和NPK基础肥料(以N 0.15g/kg，P205 0.10g/kg，K2O 0.15g/kg 干土计，其中 N、P、K 分别以(NH4) 2S04、NaH2PO4 和KCl的形式加入)拌匀。再分别加入不同含量的Cd (以分析纯CdCl2.2.5Η20形态加入)，与土壤充分混合后，加入去离子水，制备得到0、5、15mg/kg的Cd模拟污染土壤,并进行土壤预培养。在培养过程中使盆中土壤保持田间最大持水量的70%wt，土壤培养7d后，用于盆栽试验。把上述培养的土壤分装于塑料盆中，每盆装土 500g。移栽幼苗前将鲜土重10%wt的木霉发酵液(即每盆加50mL)或灭活发酵液加入土壤中，施加方式为穴施。3d后定苗，每盆3株。生长过程中用去离子水浇灌，并用称重法保持土壤含水率为最大田间持水量的70%。在培养90d和130d时,分别向植物根际部位追加一次木霉发酵液或灭活发酵液，用量均为土重的10%。植物生长150d后，用不锈钢剪刀沿土面剪取地上部，测定植株鲜重。用去离水冲洗后，105°C杀青30min，80°C烘干测干重。用不锈钢植物粉碎机磨碎植物，备用。1.7植物及土壤中重金属含量的测定植物样品用HClO4 = HNO3 (优级纯，v:v=2:3)的混合酸液消煮；土壤用HCl = HNO3 (优级纯，V:V=4:1)的混合酸液消煮。土壤中重金属有效态:土样风干后过Imm尼龙筛，用Imol/L NH4OAc (pH7)按1:5的土液质量比提取，振荡、离心后，过滤出上清液待测。上述重金属含量均用石墨炉原子吸收分光光度计(Varian SpectrAA-220FS)进行测定。1.8 土壤 pH用蒸馏水浸提，1:2.5的土水质量比提取后用pH电极测定。1.9 土壤微生物生物量碳鲜土过2mm筛后调节含水率为最大田间持水量的40%左右，再培养7d后，于25°C黑暗条件下氯仿熏蒸24h，同时，另称等量的土壤置于另一干燥器中，为不熏蒸对照处理。24h后用0.5mol/L K2SO4溶液提取(土水质量比1:4) 土壤总有机碳，300r/min振荡30min后过滤。上清液中总有机碳含量用自动总有机碳分析仪进行测定。2研究结果2.1里氏木霉FSlO-C对伴矿景天生物量的影响根据1.6所述设计盆栽实验，表I为收获时伴矿景天地上部生物量。从表I中可以看出，在加入灭活发酵液的对照组中，伴矿景天的地上部鲜重和干重均随着土壤Cd添加浓度的升高而呈现降低趋势，在15mg/kg Cd处理中地上部鲜重和干重分别仅为Omg/kg Cd处理时的62.8%和62.3%。而加入木霉发酵液的处理其地上部生物量要大于各自加入灭活发酵液的对照。不同Cd处理下，鲜重较对照提高了 10.9%(0)、21.5%(5mg/kg)、38.0%(15mg/kg),干重分别提高了 17.1% (0)、21.0% (5mg/kg)、42.5% (15mg/kg)。可见木霉发酵液的加入对伴矿景天的生长有明显的促进作用。同时，可以看出随着Cd污染水平的加大，木霉发酵液对伴矿景天的促生作用越明显。表I里氏木霉FSlO-C发酵液对伴矿景天生物量的影响
权利要求
1.保藏编号为CGMCCN0.3970的里氏木霉ijrichoderma reesei) FSlO-C联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于实施步骤为:将株高约IOcm的伴矿景天幼苗扦插到待修复土壤中，在植株根际施加里氏木霉FSlO-C发酵液或微生物制剂，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的70%wt，植物生长60 150天后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于发酵液的施加方式为:a.在移栽伴矿景天幼苗时，先将制备好的发酵液以鲜土重10%的施加量，分别在培养90d和130d时向植物根际部位追加一次木霉发酵液；b.将伴矿景天幼苗放入穴中；c.将土压紧实。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于微生物制剂的施加方式为:在移栽伴矿景天幼苗后，将制备好的木霉微生物制剂以鲜土重4%的施加量撒到土壤表面。
全文摘要
里氏木霉联合伴矿景天在镉污染农田土壤修复中的应用，将株高约10cm的伴矿景天幼苗扦插到待修复土壤中，在植株根际施加里氏木霉FS10-C发酵液或微生物制剂，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的70%wt，植物生长60～150天后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。本发明提高了镉污染农田土壤的植物修复效率；该木霉制剂提高了伴矿景天植物修复效率，增强了土壤微生物生物量，改善了土壤的微生态环境，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。
文档编号B09C1/10GK103191914SQ201310104049
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月28日 优先权日2013年3月28日
发明者滕应, 马文亭, 骆永明, 李振高, 刘五星, 吴龙华 申请人:中国科学院南京土壤研究所