一种含油污泥中石油降解菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含油污泥中石油降解菌，所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院研究所，保藏编号：CGMCC8647，分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油降解菌(RS1)，其保藏编号CGMCC8647，经过试验证实，RS1对饱和烃的降解率较高，达20.74％，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为39.69％，该细菌对石油的最适降解条件为37℃、盐度0.5％～5％、pH6～8。
【专利说明】—种含油污泥中石油降解菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，涉及降解石油烃的菌株，尤其是一种含油污泥中石油降解菌及其应用。
【背景技术】
[0002]石油是当今社会生活生产中必不可少的能源之一，同时也是全球公认的对环境最具严重影响的污染物之一。石油的勘探、开发和加工运输过程中会产生大量含油污泥。含油污泥中通常含有烷烃、芳香烃、非烃化合物和浙青质等物质，会通过土壤和地下水污染生态环境威胁人类健康，因此，含油污泥的安全处置是一个重大问题。含油污泥的处理处置，主要涉及油含量的减少以及水和油泥的分离。当前焚烧、制砖等处理方法均有一定局限性，而利用微生物对石油污染进行降解修复安全性高、无二次污染，是一项成本低、效益高且环境友好型的处理技术。由于含油污泥成分复杂难于降解，目前国内外对含油污泥的微生物降解修复研究相对较少。
[0003]申请者从渤海油田含油污泥中分离出一株高效石油烃降解菌，并进一步研究菌株对含油污泥中石油烃的降解能力，以期应用于含油污泥的微生物修复。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含油污泥中石油降解菌及其应用，本发明提供的菌种在盐度为0.5%~5%的环境下对石油烃具有25%以上的降解率。
[0005]本发明实现目的的技术方案是:
[0006]一种含油污泥中石油降解菌，其特征在于:所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC8647,分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum,保藏日期:2013年12月27日。
[0007]而且，所述降解菌对饱和烃的降解率达20.74%。
[0008]而且，所述降解菌对石油的降解条件分别为37°C、盐度0.5%~5%、pH6~8。
[0009]而且，所述降解菌对含油污泥中总石油烃的降解率为39.69%。
[0010]含油污泥中石油降解菌作为含油污泥净化剂的应用。
[0011]本发明的有益效果和优点是:
[0012]本申请从渤海油田含油污泥中分离出石油降解菌，通过16SrRNA基因序列鉴定RS1，其保藏编号CGMCC8647，经过试验证实，RSl对饱和烃的降解率最高，达20.74%，该细菌30d内对含油污泥中总石油烃(TPH)的降解率为39.69%，该细菌对石油的最适降解条件为37°C、盐度 0.5% ~5%、pH6 ~8。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为本发明温度对降解率的影响；[0014]图2为本发明盐度对降解率的影响；
[0015]图3为本发明pH值对降解率的影响；
[0016]图4为本发明TPH降解率随时间变化；
[0017]图5为本发明菌株对石油烃不同组分的降解效果。
【具体实施方式】
[0018]下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0019]本申请通过以下方法来筛选、确认菌株种类，同时提供该菌株的各项优异性能，具体内容如下:
[0020]I材料与方法
[0021]1.1含油污泥
[0022]含油污泥样品来源于渤海油田钻井岩屑，取自中海油渤海公司环保技术服务分公司，经测定油泥的含水率为70.55%，pH值为6.4，盐度3.0%。
[0023]1.2培养基
[0024]1.2.1 富集分离培养基(g/L)酵母粉 3，NaCl5, MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044, ρΗ7.2 ~7.4。
[0025]1.2.2斜面固体培养基LB固体培养基。
[0026]1.2.3 含油液体培养基(g/L)酵母粉 3，NaCl5, MgSO4.7Η200.25，(NH4)2SO4I,K2HPO4IO, ΚΗ2Ρ044,原油 10，ρΗ7.2 ~7.4。
[0027]1.3降解菌的分离和形态观察
[0028](I)称取IOg含油污泥样品，加入40mL吐温80-水溶液(1%。v/v)，静置I~2h。取上层悬浊液ImL加到含有9mL吐温水的试管中，重复以上步骤3次。分别取100 μ L菌悬液涂抹于富集固体培养基平板，于培养箱中37°C培养24h。
[0029](2)挑取形态不同的单独菌落，接种于装有50mL液体富集培养基的150mL锥形瓶中，每个菌种做3个平行，将锥形瓶置于恒温震荡培养箱中37°C、IOOrpm培养24h后进行划线分离。
[0030](3)重复步骤(2)对菌株进行纯化，直至平板上所有菌落形态一致，即为单一菌株。纯化后的菌株接种于斜面固体培养基，4°C保存。以上实验均在无菌操作条件下进行。
[0031]使用扫描电镜(SEM)对分离菌株进行形态观察。
[0032]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的石油降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为:
[0033]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0034]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0035]PCR 反应体系(50 μ L)为:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。
[0036]PCR 反应程序:94°C预变性 4min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共进行30个循环，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0037]PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。
[0038]1.4菌株的鉴定
[0039]菌株采用16SrRNA基因序列分析的方法鉴定到属。使用AXYGEN细菌DNA提取试剂盒对筛选出的石油烃降解菌进行总DNA提取，以提取的细菌总DNA作为模板，细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，PCR采用的引物为:
[0040]27F:5/ AGAGTTTGATCATGGCTCAG3'；
[0041]1492R:5/ CTACGGTTACCTTGTTACGAC3'；
[0042]PCR 反应体系(50 μ L)为:Μ?χ25 μ L，模板 2.0 μ L，引物各 1.0 μ L，ddH2021 μ L。
[0043]PCR 反应程序:94°C预变性 4min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 2min，以上共进行30个循环，72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
[0044]PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行纯化测序。
[0045]1.5降解菌的最适降解条件
[0046]将活化后的降解菌接种于装有50mL含油液体培养基的150mL三角瓶中，采用单因素实验，在其它条件因素相同的情况下，分别改变温度、盐度和PH条件进行摇瓶培养，培养7d，每组实验做三个平行，对照组不接种降解菌。采用紫外分光光度法测定培养基中石油含量，计算降解率Η (%):
[0047]
【权利要求】
1.一种含油污泥中石油降解菌，其特征在于:所述降解菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院研究所，保藏编号:CGMCC8647,分类号为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。
2.根据权利要求1所述的含油污泥中石油降解菌，其特征在于:所述降解菌对饱和烃的降解率达20.74%。
3.根据权利要求1所述的含油污泥中石油降解菌，其特征在于:所述降解菌对石油的降解条件分别为37°C、盐度0.5%~5%、pH6~8。
4.根据权利要求1所述的含油污泥中石油降解菌，其特征在于:所述降解菌对含油污泥中总石油烃的降解率为39.69%。
5.权利要求1所 述的含油污泥中石油降解菌作为含油污泥净化剂的应用。
【文档编号】C02F103/10GK104017747SQ201410072228
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】刘宪斌, 任丽君, 田胜艳, 赵兴贵 申请人:天津科技大学