复合微生态制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种复合微生态制剂及其制备方法，其解决了现有降低养殖水体污染的微生态制剂菌种单一、不能明显降低水体中氨氮和亚硝酸盐的含量的技术问题，其以粪链球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为主要成分，将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液以5～7∶3～5的体积比配制而成，本发明可广泛应用于微生态制剂制备领域。
【专利说明】复合微生态制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种复合微生态制剂及其制备方法，具体地说是一种降低养殖水体污 染的复合微生态制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 随着水产养殖业迅猛发展，养殖密度、集约化养殖程度均不断提高,养殖水质污染 成为阻碍这一领域发展的一大难题。微生态制剂对与水质污染的优势，逐渐受到人们的重 视。
[0003] 从目前来看，现有的微生态制剂虽然品种多，但产品质量参差不齐，而且菌种单 一，应用范围不够广泛，水体中的氨氮和亚硝酸盐的含量不能够明显得到降低，对养殖动物 有很大的毒害作用。
【发明内容】
[0004] 本发明就是为了解决现有降低养殖水体污染的微生态制剂菌种单一、不能明显降 低水体中氨氮和亚硝酸盐的含量的技术问题，提供一种菌种多样、能够明显降低水体中氨 氮和亚硝酸盐的含量的降低养殖水体污染的复合微生态制剂及其制备方法。
[0005] 本发明提供一种复合微生态制剂，其含有粪链球菌活菌数为1X109个/ml? 5X 109个/ml ;酿酒酵母活菌数为2X 108个/ml?IX 109个/ml ;枯草芽孢杆菌活菌数为 1 X 109个/ml?5 X 109个/ml ;地衣芽孢杆菌活菌数为1 X 109个/ml?5 X 109个/ml。
[0006] 本发明还提供一种复合微生态制剂的制备方法，其步骤如下：
[0007] (1)制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分 比的成分：葡萄糖1.2%?2.0 %、玉米浆粉1.2%?2.0%、酵母蛋白0.5%?1.0%、大 豆粉0· 2%?0· 6%、玉米面0· 1%?0· 3%、磷酸氢二钾0· 1%?0· 5%、氯化钠0· 02%? 〇· 1 %、硫酸镁〇· 01 %?〇· 02%、硫酸铵(λ 01 %?(λ 05%，其余为水，pH = 6. 5?L 5 ;
[0008] (2)制备枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液，所使用的培养基含有以 下重量百分比的成分：葡萄糖0.8%?1.5%、玉米浆粉0.5?1.0 %、酵母蛋白0.3%? 0.6%、大豆粉0· 1%?0.3%、玉米面0· 1%?0.3%、磷酸氢二钾0.02%?(λ 1%、硫酸镁 0.01%?0.02%、硫酸铵0.01%?0.05%，硫酸锰 0.005%?0.008%，其余为水，口!1 = 7. 0 ?7. 5 ;
[0009] (3)将活菌数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的粪链球菌与活菌数为4 X 108个 /ml?2 X 109个/ml的酿酒酵母的混合培养液按体积份数5?7份，和活菌数为1 X 109个 /ml?2 X 101°个/ml的枯草芽孢杆菌与活菌数为1 X 109个/ml?2 X 101°个/ml的地衣芽 孢杆菌的混合培养液按体积份数3?5份，进行配制，从而得到复合微生态制剂。
[0010] 优选地，步骤（1)中粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液的制备过程如下：
[0011] a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面分别在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培 养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28?33°C、转数200?220rpm，培养 10?18小时，得到活菌数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的粪链球菌，和活菌数为4X 108 个/ml?2 X 109个/ml的酿酒酵母，为一级发酵罐所用的种子液，所述粪链球菌和酿酒酵 母的接种量均为培养基体积的1% ;
[0012] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的5?10%，发酵条件为：温度28?33°C、培养基与所 通空气的体积比为1 :〇. 7?1. 1、搅拌转数为180?240rpm，发酵培养8?16小时，得到二 级发酵罐所用种子菌液；
[0013] c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8?10小时 后，再将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24? 36小时，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液。
[0014] 优选地，步骤c中发酵条件为：温度28?33°C ;培养基与所通空气的体积比为 1:0. 7?1. 1 ;搅拌转数为180?240rpm。
[0015] 优选地，步骤（2)中枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液的制备过程如 下：
[0016] a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下分别接种于1000ml摇 瓶的灭菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28?33°C ;转数200? 220rpm ;培养10?18小时，得到活菌数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的枯草芽孢杆菌 和活菌数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的地衣芽孢杆菌，为一级发酵罐所用的种子液， 所述草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量均为培养基体积的1% ;
[0017] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的5?10%，发酵条件为：温度28?33°C;培养基与所 通空气的体积比为1 :〇. 7?1. 1 ;搅拌转数为180?240rpm ;发酵培养8?16小时，得到 二级发酵罐所用种子菌液；
[0018] c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发 酵罐中，培养48?60小时，既得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
[0019] 本发明可降低养殖水体的氨氮和亚硝酸盐含量，而且能够拮抗病原菌，提高养殖 动物的存活率。另外混合发酵技术充分利用菌种间的互利关系，减少发酵罐的占用，并且培 养出的菌抗逆性强，效果明显。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例对本发明做进一步描述。
[0021] 本发明中所用粪链球菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌由中科院沈阳 应用生态研究所提供。
[0022] 实施例1
[0023] 首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
[0024] a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基 中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28°C、转数220rpm，培养10小时，得到活菌 数均为1 X 109个/ml -级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基 体积的1% ;
[0025] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的5%，发酵条件为：温度30°C、培养基与所通空气的体 积比为1:0. 7、搅拌转数为180rpm，发酵培养16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
[0026] c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8小时后，再将 步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养36小时。发 酵条件为：温度28°C、培养基与所通空气的体积比为1:0. 7、搅拌转数为180rpm，得到粪链 球菌和酿酒酵母混合培养液。
[0027] 粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1. 2%、玉 米浆粉2. 0 %、酵母蛋白0. 5 %、大豆粉0. 3 %、玉米面0. 2 %、磷酸氢二钾0. 2 %、氯化钠 0. 05%、硫酸镁0. 01 %、硫酸铵0. 03%，其余为水，pH = 6. 5。
[0028] 然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
[0029] a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭 菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28°C、转数220rpm，培养10小时， 得到活菌数均为2 X109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的 接种量分别培养基体积的1% ;
[0030] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的5%，发酵条件为：温度30°C、培养基与所通空气的体 积比为1:0. 7、搅拌转数为180rpm，发酵培养16小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
[0031] c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发 酵罐中，培养48小时。既得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
[0032] 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖 0. 8%、玉米浆粉0. 5%、酵母蛋白0. 3%、大豆粉0. 2%、玉米面0. 3%、磷酸氢二钾0. 02%、 硫酸镁〇. 01 %、硫酸铵〇. 01 %，硫酸锰〇. 005%，其余为水，pH = 7. 5。
[0033] 将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培 养液以7 :3的体积比进行配制，从而得到降低养殖水体污染的微生态制剂，其中粪链球菌 活菌数为5 X109个/ml ;酿酒酵母活菌数为IX 109个/ml ;枯草芽孢杆菌活菌数为IX 109 个/ml ;地衣芽孢杆菌活菌数为1 X 109个/ml。
[0034] 实施例2
[0035] 首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
[0036] a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基 中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度30°C、转数200rpm，培养16小时，得到活菌 数均为2 X 109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养 基体积的1% ;
[0037] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的7%，发酵条件为：温度28°C、培养基与所通空气的体 积比为1:1、搅拌转数为220rpm，发酵培养12小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
[0038] c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养9小时后再将 步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养30小时。发 酵条件为：温度30°C、培养基与所通空气的体积比为1:1、搅拌转数为200rpm，得到粪链球 菌和酿酒酵母混合培养液（活菌数为2. 8 X 109个/ml)。
[0039] 粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖1. 5%、玉 米浆粉1. 2 %、酵母蛋白1. 0 %、大豆粉0. 2 %、玉米面0. 1 %、磷酸氢二钾0. 1 %、氯化钠 0. 02%、硫酸镁0. 015%、硫酸铵0. 01 %，其余为水，pH = 7. 0。
[0040] 然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
[0041] a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭 菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度30°C、转数200rpm，培养16小时， 得到活菌数均为3 X109个/ml的一级发酵罐所用的种子液，草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的 接种量分别培养基体积的1% ;
[0042] b.将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养 基装量为70L，接菌量为培养基体积的7%，发酵条件为：温度28°C、培养基与所通空气的体 积比为1:1、搅拌转数为220rpm，发酵培养12小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
[0043] c.将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发 酵罐中，培养54小时。既得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
[0044] 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖 1. 0 %、玉米浆粉0. 6 %、酵母蛋白0. 5 %、大豆粉0. 1 %、玉米面0. 2 %、磷酸氢二钾0. 03 %、 硫酸镁〇. 02 %、硫酸铵0. 02 %，硫酸锰0. 007 %，其余为水，pH = 7. 3。
[0045] 将粪链球菌与酿酒酵母的混合培养液和枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培 养液以5 :5的体积比进行配制，从而得到降低养殖水体污染的微生态制剂，其中粪链球菌 活菌数为IX 1〇9个/ml ;酿酒酵母活菌数为2 X 108个/ml ;枯草芽孢杆菌活菌数为5 X 109 个/ml ;地衣芽孢杆菌活菌数为5X 109个/ml。
[0046] 实施例3
[0047] 首先制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，具体过程如下：
[0048] a.将粪链球菌和酿酒酵母的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基 中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度33°C、转数210rpm，培养18小时，得到活菌 数均为5 X 109个/ml -级发酵罐所用的种子液，粪链球菌和酿酒酵母的接种量均为培养基 体积的1% ;
[0049] b.将步骤a培养的种子液接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装 量为70L，接菌量为培养基体积的10 %，发酵条件为：温度33°C、培养基与所通空气的体积 比为1:1. 1、搅拌转数为240rpm，发酵培养8小时，得到二级发酵罐所用种子菌液；
[0050] c.将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养10小时后再将 步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24小时。发 酵条件为：温度33°C、培养基与所通空气的体积比为为1:1. 1、搅拌转数为240rpm，得到粪 链球菌和酿酒酵母混合培养液（活菌数为5 X 109个/ml)。
[0051] 粪链球菌和酿酒酵母的混合培养基的培养基配方按重量比为葡萄糖2.0%、玉 米浆粉1. 5 %、酵母蛋白0. 6 %、大豆粉0. 6 %、玉米面0. 3 %、磷酸氢二钾0. 5 %、氯化钠 0. 1 %、硫酸镁0.02%、硫酸铵0.05%，其余为水，pH = 7.0。
[0052] 然后制备枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液，具体过程如下：
[0053] a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭
【权利要求】
1. 一种复合微生态制剂，其特征是含有粪链球菌活菌数为1X ?ο9个/ml?5 X 109个/ ml ;酿酒酵母活菌数为2 X 108个/ml?1 X 109个/ml ;枯草芽孢杆菌活菌数为1 X 109个/ ml?5 X 109个/ml ;地衣芽孢杆菌活菌数为1 X 109个/ml?5 X 109个/ml。
2. -种复合微生态制剂的制备方法，其特征是步骤如下： (1) 制备粪链球菌和酿酒酵母的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量百分比的 成分：葡萄糖1.2%?2.0 %、玉米浆粉1.2%?2.0%、酵母蛋白0.5%?1.0%、大豆粉 0· 2%?0· 6%、玉米面0· 1%?0· 3%、磷酸氢二钾0· 1%?0· 5%、氯化钠0· 02%?0· 1%、 硫酸镁0.01%?0.02%、硫酸铵0.01%?0.05%，其余为水，？!1 = 6.5?7.5; (2) 制备枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液，所使用的培养基含有以下重量 百分比的成分：葡萄糖0.8%?1.5%、玉米浆粉0.5?1.0%、酵母蛋白0.3%?0.6%、大 豆粉0· 1 %?0.3%、玉米面(λ 1 %?0.3%、磷酸氢二钾0.02%?(λ 1 %、硫酸镁0.01 %? 0.02%、硫酸铵0.01%?0.05%，硫酸锰0.005%?0.008%，其余为水邛!1=7.0?7.5; ⑶将活菌数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的粪链球菌与活菌数为4 X 108个/ml? 2 X 109个/ml的酿酒酵母的混合培养液按体积份数5?7份，和活菌数为1 X 109个/ml? 2 X 101°个/ml的枯草芽孢杆菌与活菌数为1 X 109个/ml?2 X 101°个/ml的地衣芽孢杆菌 的混合培养液按体积份数3?5份，进行配制，从而得到复合微生态制剂。
3. 根据权利要求2所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤（1)中粪 链球菌和酿酒酵母的混合培养液的制备过程如下： a. 将粪链球菌和酿酒酵母的斜面分别在无菌环境下接种于1000ml摇瓶的灭菌培养基 中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28?33 °C、转数200?220rpm，培养10? 18小时，得到活菌数为2X109个/ml?1X10 1(I个/ml的粪链球菌，和活菌数为4X108个/ ml?2 X 109个/ml的酿酒酵母，为一级发酵罐所用的种子液，所述粪链球菌和酿酒酵母的 接种量均为培养基体积的1% ; b. 将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装 量为70L，接菌量为培养基体积的5?10%，发酵条件为：温度28?33°C、培养基与所通空 气的体积比为1 :〇. 7?1. 1、搅拌转数为180?240rpm，发酵培养8?16小时，得到二级发 酵罐所用种子菌液； c. 将步骤b所得的粪链球菌的种子菌液接种到二级发酵罐中，培养8?10小时后，再 将步骤b所得的酿酒酵母的种子菌液接到该二级发酵罐中与粪链球菌混合培养24?36小 时，得到粪链球菌和酿酒酵母混合培养液。
4. 根据权利要求3所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤c中发酵 条件为：温度28?33°C ;培养基与所通空气的体积比为1:0. 7?1. 1 ;搅拌转数为180? 240rpm〇
5. 根据权利要求4所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于所述步骤（2)中枯 草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌的混合培养液的制备过程如下： a.将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的斜面在无菌环境下分别接种于1000ml摇瓶的灭 菌培养基中，培养基装量为300ml，摇床培养条件为：温度28?33°C ;转数200?220rpm ; 培养10?18小时，得到活菌数为2X 109个/ml?IX 101°个/ml的枯草芽孢杆菌和活菌 数为2 X 109个/ml?1 X 101°个/ml的地衣芽孢杆菌，为一级发酵罐所用的种子液，所述草 芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的接种量均为培养基体积的1% ; b. 将步骤a培养的种子液分别接种于100L-级种子发酵罐的灭菌培养基中，培养基装 量为70L，接菌量为培养基体积的5?10%，发酵条件为：温度28?33°C;培养基与所通空 气的体积比为1 :〇. 7?1. 1 ;搅拌转数为180?240rpm ;发酵培养8?16小时，得到二级 发酵罐所用种子菌液； c. 将步骤b所得的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子菌液同时接种到二级发酵罐 中，培养48?60小时，既得枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合培养液。
【文档编号】C02F101/38GK104087543SQ201410375356
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】耿建, 王燕, 李贵杰, 夏冰 申请人:威海金牌生物科技股份有限公司