三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用的制作方法

专利名称：三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用的制作方法
三聚m^ 印迹固^^小股鬼恪雄和細
狱领域
本发明涉及分析化学、食品安封页域，具体地说，是涉^H聚,分子印迹固禾,小tt^帝恪方
法和，，并主要用于^^品中三聚mH，留的高选择性分离、富集和纯化。 背景狱
三聚離(melamine)，是一种三麟^M^有机化她觀的M^T有机虹原J斗，简称HI安， 俗總胺、蛋白精。由于我国翻偶则食品和i^斗IQlk蛋白质賴的方法，导致裕商人将三聚飼嫌 杂在食品或t^斗中，以提將品或^N^测中的蛋白质含量撤示。作为一种常见的《红原J斗，三聚齣安 被认为毒性轻微，但是长WAH聚劇^t^缠、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可进""^ 诱^li胱癌。2007年，美国爆发宠trt品受污染事件，事后调鼓明矛錄了^6.6%三聚離的小魏 白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆^E^婴幼JWy受污染事件，导致食用了受污 染奶粉的婴幼jl^生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。2008年10月8日，卫生部、， 和信息化部、 部、国紅商行政管理总局和国家质離督检验^^、局耳^^发布公告，制^H聚氰 月銥乳与乳制品中的临日措理值:婴幼儿配方乳粉中三聚割安的限量m^ lm^kg，液态奶(包括原料乳)、 鹏、其它配方孚im中三聚飼安的限量働2.5m^kg，含乳15%以上的其它食品中三聚観安的限量戯 2.5mg^g，高于限量值的产品一軒得销售。目前，X寸于鹏'j品中三聚割鈔戋留含量的检测是一个及其 复杂的过程，由于鹏榀中基质非常鋭，样品的前处Sii程非f^。用固才,、 叙彌脇中的三
聚ftl安謝ff^b理，方法简单、方便、十娥。但是，现有固+,小柱均是一次幽柳，价格昂贵；三 聚mi安属于强极性化糊，在传统的Q8固相魏小肚的保節蹉；鹏子交换跟,小柱不能很 好地分离三聚籠安与鹏U品中的内源性小^^成分的干扰。同时，普通固相魏方法予Mb理的样品由于 背景依然鄉鋭，必须结^t相质谱糊仪、液相质谱糊仪等，需要专业人员操作，检测费用髙昂， 无法在常规检测中进行普及。

发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，亂共一种三聚籂5^印迹固相靴小极制备方法和細，
以方便、个娥、高效i雌择性纯化和富ft^粉、牛奶等鹏脇提取液中的三聚ms势戋留，结合高效液相 色谱即可实aiBfiu品中三聚割安鹏的分析，便于在例行分析樹则中普及与mr。
本发明^iii以下技术方案实现的
三聚割^r印迹固才,小柱，期寺征是内底有一石^f^満板的鹏小柱中填i有三聚割安舒 印迹聚激颗粒。本发明中三聚m^^印迹固ffiw小柱的第恪方法，^mE在^s以下步骤
(1) 首先制备含有三聚離的針印迹聚糊,
将三聚mi安、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酉^S照1: 6~18: 3(M00的比例超声分散于甲醇 棘乙醇的7JC溶液中，在3(^80度^{牛下 过夜；力口入偶iU异丁腈之后，氮吹織10併中密封反 应器，在氮气^^下油浴60度SiS24小时，得到块状^T印迹聚^t);辦央状^T印迹聚^tl用石琳 磨碎，过10(M000目筛，得到大小为15(M3 f魷且含有三聚離的籽印迹聚^/PF立；
(2) 将J^含有三聚W安的好印迹聚^tl^^體矜10%乙酸的甲^§液中，在索氏提取器中 提取48小时以除去三聚 ^*鹏的化^#/;再经j^fe涤并反复沉降，滤去,，将获得阶沉M
粒物真空千鹏亘重，即为三聚mjK^印迹聚激颗称
(3) 最后制备三聚割安肝印迹固才m(小柱
繊5(M0(X) mg ±^^聚飼安好印迹聚^/颗粒，以乙腈为匀浆液填充于麟为^^僻板的 1~5 mL鹏小柱内，自然凉干或氮气吹干鹏小柱制得三聚tl安好印迹固相魏小柱。
以上步骤戶;M试剂中，三聚離、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酉鹏自Sigma公司，甲醇、 乙腈购自Merck公司。
本发明中戶脱的三聚割^ 印迹固相魏小ffi^于鹏榀中三聚WW留样品提取液的高选择 性分离、富集、纯化，其特征包括以下步骤-
(1) 将J^三聚i^分子印迹固相,小柱依次用水l 10mL、甲醇l 10mL活化，最终用氮气 吹干备用；
(2) 鹏ij品三聚fftff安提取液1 5 mL滴加SH聚MI安好印迹固相魏小柱，以0.1~0.5 mL/min 的mi固相魏小柱，并用氮气吹干固相M小法
(3) 依7細去离子水l 10mL和甲醇W0mU概固相魏小柱，i/1BI》0.W).5mL/min，并用
氮气吹干固相魏小柱；
(4) 驗用l 10mL含5。/^5(f/o^ifeK的甲瞎娜，》腿为0.M).5mL/min，收^^I^液；
(5) 淵兑液氮吹M至干，用甲醇定容至lmL， ^mM高效液相色衞义测^H聚mB安的^M。
本发明戶;ffi幌的三聚M針印迹聚创勿颗粒是具有一定大小、m^和的特定的功自感团的高好
聚^tl颗粒，对三聚锢安的針结构具有特定的'H己忆"功能。戶満i恪的三聚割安好印迹固相靴小柱 实现了鹏U品中三聚齣安的高效分离、富鮮纯化，与以往普通激MS(法、d8固相^^法、离子交 换固相^(S"等相^S樹目比，富集、净化效率高，并_§^聚,^> 印迹固相魏小柱可以鼓使用，
^*低，可Mi^为，ij品中三聚iWM留前^a的必备的手段。
本发明的三聚節安舒印迹固相魏小柱，^#征是内底有一石^!#板的鹏小柱中±真棘三聚 繊好印迹聚^t^l立。取5(M000mg的Jd^H聚割^H"印迹聚^/P^立，以乙腈为匀浆液填充于麟为石^^m的s^小柱内，自然晾干鋼氮气吹干鹏小柱鹏寻三聚齙安肝印迹固t,小柱。
鹏小柱的容积为l~5mL。
i^H聚繊、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯翻旨为分WMi叙y，最佳比例范围为1: 9~15: 40~80， 舒印迹聚^J^fe大小范围最佳为100~30 ，石^^僻lfcS佳孔径范围为10~20 。
实施例1.
一.三聚W^ 印迹固相魏小柱制备
(1) 含有三聚W安的針印迹聚^/^^立的制备
将三聚 安、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯翻淑照l: 12: 60的比例超声分散于50%的甲醇 水溶液中；50度斜牛下^Nii夜；力口入偶fc异丁腈之后，氮吹驗10倂中密封S^器，在氮气做 下油浴60度鹏24小时，得到跌状舒印迹聚^t/;将块状好印迹聚^tl用石il^離，过400目筛， 得到PK大小为35 m^且含^"三聚mjK的^ 印迹聚^^4;
(2) 聚激鹏中三聚繊的薩 将J^含有三聚镧安的OT印迹聚^t/颗^g^ 10%乙酸的甲^^液中，在索氏提取器中提取48
小时，除去三聚割安诚鹏的化溯；经翻洗涤并反复沉降，滤去翻'将获得的沉〖^i粒物真空 千鹏隨'即为三聚割安好印迹^tJ颗粒；
(3) 三聚ty安針印迹固相魏小柱的制备
称观100 mg i^^聚tlB安分子印迹聚糊^l立，以乙腈为匀浆液i真JS于底端为石5^錦板的1 mL ^i驾小柱内，自然凉干或氮气吹干鹏小柱制得三聚観安^^印迹固相魏小柱。
二三聚簡^^印迹固相,小ttlSffl于奶粉中三fm8安残留样品提取液的高选择性分离、富集、
纯化
(1) 0.5 5WWJ卩入甲醇5mL，漩f赚荡一倂中，超声提取30倂屮。以10000 ^Ht离心5併屮， 上清液作为娜提取液；
(2) 三聚,^ 印迹固相，小柱依次用水2mL、甲醇2mL活化，用氮气吹干备用；
(3) 鹏临三聚fll^l取液1 mL滴加M^聚^^印迹固W^小柱，以0.25 mL/min的 31固 fflM小柱，用氮气吹干固木,小柱；
(4) 做鄉去离子水2mL和甲醇2mL鹏固+,小柱，？繊为0.25 m]7min，用氮气吹干固相萃 取小柱；
(5) 蔬用3mL含KP/omE7jC的甲B iM，》iBI为025ml7min， tB^fel^液；
(6) M液氮吻鄉至干，用甲醇定容至lmL，灘柳高效液相色i靴测^H聚繊的賴。 戶顾嗨的固^ 小根 ^冲的三聚翻安具有专^￡掛魁也富鮮纯化，5! &样品提取働口标
2.5mg^三聚tU3安，三聚mi安的回收率为91.2%。实施例2.
一.三聚 3$^印迹固才,小柱制备
(1) 含有三聚WI安的好印迹聚^t^粒的讳恪
将三聚節安、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酉敏照1: 9: 45的比例超声分散于75%乙醇的 7R溶液中；60度斜牛下 *过私加入偶氮二异丁fl青之后，氮吹麟10倂中密务1S^器，在氮气fW 下油浴60度鹏24小时，得到块状針印迹聚彌；将块状好印迹聚^t/用石if^磨碎，过200目筛， 得到Sf立大小为75旨且含有^^mi安的W印迹聚^t)^f立；
(2) 聚溯颗粒中三聚離的灘 将±^含有三聚 3安的好印迹聚^ *立置矜10%乙酸的甲^#液中,在索氏提取器中提取48
小时以除去三聚 3^*鹏的化激；鞭^ 先涤并反复沉降，滤去剛，^^得盼沉i^^粒物真
空^pbm恒重，即为三聚mi^t印迹聚^ti^^;
(3) 三聚mis^印迹固ffiw小柱的条恪
称艰1000 mg J^H聚WS^印迹聚^tl颗粒，以乙腈为匀浆液填充于麟为石^^僻板的5 mL 玻璃小柱内，自然凉千或氮气吹干玻难小柱制得三聚観安好印迹固木@ 小柱。
二三聚 安^印迹固相 小|±^于液态奶中三聚鐘安残留样品提取液的高选择性分离、富
集、纯化
(1) 1 mL液态奶加入乙腈3 mL，静置3她以讓0 t^H中离心5併中，上清液作为液态鹏 取液。
(2) 三聚割安分子印迹固相，小禾挑次用水5mL、甲醇5mL活化，用氮气吹干备用；
(3) 鹏ij品三聚itl安提取液3 mL滴加至三聚WK^ 印迹固相魏小柱，以0.5 mL/min的MS固 丰IW小柱，用氮气吹干固相魏小柱；
(4) 依 細去离了水5mL和甲醇5mUm固相,小柱，$臓为0.5 mL/min，用氮气吹干固ffi^ 小法
(5) 最后用5raL含10y。浓M7jC的甲瞎舰，i^IA0.5mL/min，收* 液；
(6) ^K液氮吻鄉至干，用甲醇定容至lmL， ^^M高效液相色itft测^H聚m^安的含量。 戶賴幌的固相靴小敏中液态奶中的三聚割安具有专^^择性地富te纯化，对應 样品提取液
中力口标2.5mg/L三聚劉安，三聚劉安的回收率为95.1%。
权利要求
1、三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。
2、 如权利要求1所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征在于 上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒大小为150~13微米。
3、 如权利要求1所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征在于 上述石英砂筛板的孔径范围为10~20微米。
4、 三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备方法，其特征在于包括以下 步骤(1)首先制备含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基双丙烯酸酯按照l: 6~18:30 100的比例超声分散于甲醇或者乙醇的水溶液中，在30 80度条件下搅 拌过夜；加入偶氮二异丁腈之后，氮吹除氧10分钟密封反应器，在氮气保 护下油浴60度反应24小时，得到块状分子印迹聚合物；将块状分子印迹聚 合物用研钵磨碎，过100 1000目筛，得到大小为150 13微米，含有三聚氰 胺的分子印迹聚合物颗粒；(2) 将上述含有三聚氰胺的分子印迹聚合物颗粒置于含10%乙酸的甲 醇溶液中，在索氏提取器中提取48小时以除去三聚氰胺及未反应的化合物； 再经丙酮洗涤并反复沉降，滤去丙酮，将获得的沉淀颗粒物真空干燥至恒 重，即为三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒；(3) 最后制备三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱称取50~1000 mg上述三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒，以乙腈为匀浆 液填充于底端为石英砂筛板的1~5 mL玻璃小柱内，自然凉干或氮气吹干 玻璃小柱制得三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。
5、 如权利要求4所述的三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱的制备方法， 其特征在于上述甲醇或者乙醇的水溶液是甲醇或者乙醇与水的体积比为 1 10: 1的混合溶液。
6、 三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提取液中三聚氰胺残 留样品的选择性分离、富集、纯化，其特征包括以下步骤(1) 将上述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱依次用水1 10 mL、甲醇 1 10mL活化，用氮气吹干备用；(2) 奶制品三聚氰胺提取液1~5 mL滴加至三聚氰胺分子印迹固相萃取 小柱，以0.1 0.5mL/min的速度过固相萃取小柱，用氮气吹干固相萃 取小柱；(3) 依次用去离子水1 10mL和甲醇1 10mL淋洗固相萃取小柱，流速 为0.1-0.5 mL/min，用氮气吹干固相萃取小柱；(4) 最后用1 10 mL含5 % 50%浓氨水的甲醇洗脱，流速为0.1~0.5 mL/min，收集洗脱液；(5) 洗脱液氮吹浓縮至干，用甲醇定容至lmL，洗脱液用高效液相色谱 仪测定三聚氰胺的含量。
7、 如权利要求6所述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提 取液中，其特征在于上述奶制品三聚氰胺提取液制备方法是1克奶粉加入 甲醇5 10mL，漩涡振荡一分钟，超声提取30分钟，以10000转每分钟离 心5分钟，上清液作为固态奶提取液。
8、 如权利要求6所述三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱应用于奶制品提 取液中，其特征在于上述奶制品三聚氰胺提取液制备方法是1mL液态奶， 加入乙腈1 5 mL以除去蛋白，并以10000转每分钟离心5分钟，上清液 作为液态奶提取液。
全文摘要
本发明公开了三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱及制备方法和应用。三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱，其特征是内底有一石英砂筛板的玻璃小柱中填充有三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒。将三聚氰胺、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯混合分散于甲醇或者乙醇的水溶液中，制得三聚氰胺分子印迹聚合物颗粒填充于玻璃小柱内，得到三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱。本发明实现了对奶制品中三聚氰胺的高效分离、富集与纯化，与以往普通溶剂萃取法、C₁₈固相萃取法、离子交换固相萃取法等相关技术相比，富集、净化效率高，并且三聚氰胺分子印迹固相萃取小柱可以重复使用，成本低，可望成为奶制品中三聚氰胺残留前处理的必备的手段。
文档编号B01J20/285GK101513577SQ200910014658
公开日2009年8月26日 申请日期2009年3月1日 优先权日2009年3月1日
发明者周文辉, 杨黄浩, 林黎明, 王小如, 郭秀春 申请人:国家海洋局第一海洋研究所