专利名称：基于多肽组合手性识别库的手性药物拆分介质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基于多肽组合识别库的手性药物拆分介质及其制备方法。
背景技术：
以手性固定相(Chiral stationary phase, CSP)为基础的高效液相色谱法能广泛适用于各类化合物，适于常规及生物样品的分析测定，制备分离快速方便，定量分析的可靠性较高，采用此法研究考察的化合物已达数千种之多，其已经成为目前最主要的途径之一。用于液相色谱手性分离的手性固定相种类很多，如蛋白类(Proteins)、多糖类(Polysaccharides)、聚合物类(Chiralpolymers)、冠醚类(Crownethers)、环糊精类 (cyclodextrin)、配体交换型(含氨基酸残基或其它可以与类似金属铜的离子产生络合的基团)、分子设计型(Pirkle型)及分子烙印型(Molecularly imprinted polymers)等，其中常用的是蛋白类、多糖类和环糊精类手性固定相。最近发展的有大环抗生素(万古霉素vancomycin和替考拉宁teicoplanin), Lindner和其合作者发展的几种基于奎宁和奎尼丁的手性分离介质。在蛋白类手性固定相中，通常采用的蛋白包括牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin, BSA)、人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)、α-酸性糖蛋白(a -Acidglycoprotein, AGP)、抗生素蛋白、卵清白蛋白和胰蛋白酶、胃蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶及纤维素酶等酶类，也有通过三个缬氨酸残基连接有另外手性识别位点的手性键合固定相，并具有较好的手性识别能力。其中BSA最为常用。目前合成BSA-CSP有很多方法，如戊二醒法、N, N - disuccinimidyl carbonate (DSC)法、三聚氯氰法和羰基咪唑法等。目前商品化的蛋白类手性色谱固定相主要是白蛋白(如HSA)和α -酸性糖蛋白(α _AGP)，其可以拆分很多种手性化合物，但是其作用机理还模糊不清；此外此类手性固定相表面键合量、稳定性以及样品负载量均较小。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种基于多肽组合识别库的手性药物拆分介质及其制备方法，所得到的手性药物拆分介质具有较广泛手性拆分范围和表面分布均匀、键合密度较高。本发明提供的技术方案是基于多肽组合手性识别库的手性药物拆分介质，由具有手性识别能力的多肽组合库通过化学修饰键合至孔径为8 12nm，粒径5mnT30_的多孔硅胶表面得到。上述多孔硅胶为通过含末端氨基的硅烷化试剂修饰得到含末端氨基的修饰硅胶；拆分介质的含碳量为8 15%，含氮量为5 12%，以上百分比为质量比。上述多肽组合库通过对与药物相关的蛋白的一种或两种以上蛋白于25 37°C进行酶解得到。
所述蛋白为α-酸性糖蛋白、白蛋白、卵清白蛋白、牛血清白蛋白。本发明还提供了上述手性药物拆分介质的制备方法，将与药物相关的蛋白的一种或几种以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或弹性蛋白酶或它们中的一种或几种酶于25 37°C进行酶解，酶解后得到的多肽组合库以变性及吸附或透析的方法除去酶蛋白，然后通过化学修饰键合至多孔硅胶表面，即得所需手性药物拆分介质。本发明制得的基于多肽组合识别库的手性药物拆分介质具有广泛手性拆分范围、表面分布均匀、键合密度较蛋白质类固定相高，其表面具有的组合手性识别库可用于多种手性药物的拆分及分析，为发展分离范围更广的手性分离材料以及特异性更好的手性药物提供依据。
具体实施例方式实施例I :取2^10g0V (卵清白蛋白)以pH8. I的缓冲溶液溶解之，添加5%胰蛋白 酶溶液(PH3. O)至总溶液中含相当于O. 5%的胰蛋白酶，于25 36°C下进行酶解5 30分钟，酶解后得到的多肽组合库以调节温度的方法除去酶蛋白。然后取IOg孔径为8nm、粒径5mm的氨基修饰的多孔硅胶，先与羰基米唑(CDI)在乙腈中反应，反应结束后过滤洗涤，接着与上述除酶蛋白的溶液(调整PH7. O)于6(T90°C反应2 10小时，反应产物过滤并以乙醇洗涤数次后，干燥得所需拆分介质。该拆分介质的含碳量为8. 0%。实施例2 :取2 IOgOV (卵清白蛋白)以ρΗ8· 5的缓冲溶液溶解之，添加1%弹性蛋白酶溶液(ΡΗ8. 5)至总溶液中含相当于O. 1%的弹性蛋白酶，于28 37°C下进行酶解5 30分钟，接着将酶解后得到的多肽组合库以调节温度的方法除去酶蛋白。然后取IOg孔径为10nm、粒径IOmm的氨基修饰的多孔硅胶，与例I中相似的处理方法处理后，再与上述除酶蛋白的溶液(调整PH至7. 0)，于6(T90°C反应2 10小时，反应产物过滤并以乙醇洗涤数次后，干燥得所需拆分介质。该拆分介质的含碳量为8.4%。实施例3 :取2 IOgBSA (牛血清白蛋白)以pH8. I的缓冲溶液溶解之，添加5%胰蛋白酶溶液(PH3. O)至总溶液中含相当于O. 5%的胰蛋白酶，于25 36°C下进行酶解5 30分钟，重金属变性除酶，过滤，滤液中加入弹性蛋白酶约相当于总溶液量的O. 1%，于28 37°C下酶解5 15分钟，接着以酶解后得到的多肽组合库以变性及过滤的方法除去酶蛋白。然后取IOg孔径为8nm、粒径30mm的氨基修饰的多孔硅胶，与例I中相似处理后，再与上述除酶蛋白的溶液(调整PH至7. 0)，于6(T90°C反应2 10小时，反应产物过滤并以乙醇洗涤数次后，干燥得所需拆分介质。该拆分介质的含碳量为11.2%。实施例4 :取2 IOgBSA (牛血清白蛋白)以pH8. 5的缓冲溶液溶解之，添加1%弹性蛋白酶溶液(PH8. 5)至总溶液中含相当于O. 5%的弹性蛋白酶，于28 37°C下进行酶解5 30分钟，迅速加热，过滤，滤液以HCl调节pH至7. O。然后取IOg孔径为12nm、粒径20mm的氨基修饰的多孔硅胶，经过同例I相似处理后，与上述除酶蛋白的溶液(调整PH至7. O),于6(T90°C反应2 10小时，反应产物过滤并以乙醇洗涤数次后，干燥得所需拆分介质。含碳量为 10. 3%ο实施例5 -M 2 IOg α -酸性糖蛋白以ρΗ8. I的缓冲溶液溶解之，添加5%胰蛋白酶溶液(Ph3. O)至总溶液中含相当于O. 5%的胰蛋白酶，于25 36°C进行酶解5 30分钟，变性除蛋白，过滤。然后取IOg孔径为8nm、粒径8mm的氨基修饰硅胶，与例I中相似处理，再与上述除酶蛋白的溶液(调PH至7. O),于6(T90°C反应2 10小时，反应产物过滤并以乙醇洗涤数次后，干燥得所需拆分介质。含碳量8.3%。
实施例6 :取上述例中之产品5. 0g，匀浆法装柱(15x4)，得到手性药物拆分色谱柱，经过测试可有效地拆分酮基布洛芬、华法令、萘普生等手性对映体药物。
权利要求
1.基于多肽组合手性识别库的手性药物拆分介质，由具有手性识别能力的多肽组合库通过化学修饰键合至孔径为8 12nm，粒径5mnT30_的多孔硅胶表面得到。
2.根据权利要求I所述的手性药物拆分介质，其特征在于所用多孔硅胶为通过含末端氨基的娃烧化试剂修饰得到含末端氨基的修饰娃胶；拆分介质的含碳量为8 15%，含氮量为5 12%，以上百分比为质量比。
3.根据权利要求I或2所述的手性药物拆分介质，其特征在于所述多肽组合库通过对与药物相关的蛋白的ー种或两种以上蛋白于25 37°C进行酶解得到。
4.根据权利要求3所述的手性药物拆分介质，其特征在干所述蛋白为α-酸性糖蛋白、白蛋白、卵清白蛋白、牛血清白蛋白。
5.权利要求I所述的手性药物拆分介质的制备方法，其特征在于将与药物相关的蛋白的一种或几种以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或弹性蛋白酶或它们中的一种或几种酶于25 37°C进行酶解，酶解后得到的多肽组合库以变性及吸附或透析的方法除去酶蛋白，然后通过化学修饰键合至多孔硅胶表面，即得所需手性药物拆分介质。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所用多孔硅胶为通过含末端氨基的硅烷化试剂修饰得到含末端氨基的修饰硅胶。
全文摘要
基于多肽组合识别库的手性药物拆分介质，由具有不同手性识别能力的多肽组合库通过化学修饰键合至孔径为8~12nm，粒径5~30mm的多孔硅胶表面得到。上述手性药物拆分介质的制法，将与药物相关的蛋白的一种或几种以胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或弹性蛋白酶或它们中的一种或几种酶于25~37℃进行酶解，酶解后得到的多肽组合库以变性及吸附或透析的方法除去酶蛋白，然后通过化学修饰键合至多孔硅胶表面，即得所需手性药物拆分介质。本发明制得的手性药物拆分介质具有广泛手性拆分范围、表面分布均匀、键合密度较蛋白质类固定相高，其表面具有的组合手性识别库可用于多种手性药物的拆分及分析，为发展分离范围更广的手性分离材料以及特异性更好的手性药物提供依据。
文档编号B01J20/29GK102688750SQ201110068220
公开日2012年9月26日 申请日期2011年3月22日 优先权日2011年3月22日
发明者刘武, 宋文彩, 邱华 申请人:武汉惠世通生物工程有限公司