专利名称：一种基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物医学材料领域，特别是涉及一种体外内毒素吸附介质的制备及其使用方法。
背景技术：
内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌在生长、分裂时释放或死亡时裂解出来的细胞壁外膜上的特有结构。由于革兰氏阴性菌非常顽固，在水中只需极少的养分即可存活，因而内毒素广泛存在于饮用水、食品、生物医药制剂中及接触水溶液的器壁上；在高等生物体内，胃肠道下端的革兰氏阴性菌属是生物体内毒素的主要来源，细菌死亡后释放的内毒素会进入血液循环而引起一系列病理变化。医院临床在使用药品注射剂时若含细菌内毒素大于lEU/mL，则病人会产生寒战、发热、呕吐、肤色灰白、休克甚至死亡等热源反应，因此国家药典对注射品中细菌内毒素指标有着严格规定，其限度水平为每单位体重5EU。目前常用的去除内毒素的方法有活性炭吸附、超滤、萃取、亲和层析等，但前三种方法只适合于从相对较稳定的小分子物质中去除内毒素，且有效成分损失较大；亲和层析虽然选择性较好，但是也存在着装柱、预处理等耗时步骤，且处理量较小。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种内毒素吸附介质及其使用方法，该内毒素吸附介质不仅对于内毒素具有较高的选择性，并且使用方便，适于大量生物制品中内毒素的去除。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案一种基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其制备方法包括如下步骤(1)先将磁性材料分散在含乙酸溶液中，加入壳聚糖得到水相I，再将该水相I转移至含有司盘80的液体石蜡中，以戊二醛为交联剂，采用反相悬浮法制得磁性壳聚糖微球；所述的磁性物质为四氧化三铁或铁；(2)将磁性壳聚糖微球分散到二甲基亚砜与氢氧化钠的混合溶液中，再加入环氧氯丙烷活化，去离子水洗涤至中性，得到活化后产物；(3)将活化后产物置于内毒素亲和配基溶液中固载，即得到所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质；所述的内毒素亲和配基为组氨酸、精氨酸、多聚赖氨酸、多粘菌素B或四乙烯五胺。进一步，本发明推荐步骤(1)具体按照如下进行将磁性材料超声分散到乙酸溶液中，加入壳聚糖后搅拌均勻得到水相I，水相I中壳聚糖的浓度为10 40g/L，乙酸浓度为10 50mL/L，磁性材料与壳聚糖的投料质量比为0.2 1 1 ；然后将水相I加入到含有0. 1 2vol%司盘80的液体石蜡中，水相I与含有0. 1 2vol%司盘80的液体石蜡的混合体积比为1 1 5;混勻后加入戊二醛，所加入的戊二醛与壳聚糖氨基的摩尔比为 1 0.1 6，加毕调整温度至25 50°C反应1 3小时，然后调整体系pH至10 13，升温至50 80°C，继续搅拌反应，充分反应后分离产物，经洗涤、干燥得到磁性壳聚糖微球。更进一步，上述步骤(1)中，较佳的壳聚糖浓度为30 40g/L;戊二醛与壳聚糖氨基的摩尔比优选为1 1 2 ；PH调至10 13以后温度升至70°C反应2 3小时为宜。进一步，本发明推荐所述的步骤( 具体按照如下进行将磁性壳聚糖微球分散到二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液中，然后加入环氧氯丙烷在振荡下于25 50°C进行活化反应，充分反应后过滤、洗涤至中性、干燥得到所述的活化后产物；所述二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液由二甲亚砜与0. 1 2mol/L的氢氧化钠水溶液按照体积比1 0. 25 5配制得到，所述环氧氯丙烷与二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液的投料体积比为1 50 100，磁性壳聚糖微球与环氧氯丙烷的投料质量体积比为lg/Ι 10mL。更进一步，上述步骤( 中，二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液中氢氧化钠终浓度控制在0.5 lmol/L为宜。本发明推荐所述的步骤(3)具体按照如下进行将活化后产物置于0.1 0. 5mol/L内毒素亲和配基溶液中，调节pH至10 12，于20 50°C振荡反应过夜，反应完毕后过滤、洗涤至中性、干燥即得所述的内毒素吸附介质。更进一步，活化后产物与0. 1 0. 5mol/L内毒素亲和配基溶液的质量体积比为 0. 1 lg/10mL。本发明还提供了所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质的使用方法，所述使用方法具体为取内毒素吸附介质用脱氧胆酸钠水溶液(优选质量浓度0.5 1.0%的脱氧胆酸钠水溶液)洗涤，再用无热原水充分洗涤，干燥后分散到含有内毒素的待处理溶液中，充分振荡或搅拌，然后外加磁场，取出上清液即为处理后溶液。与现有技术相比，本发明的有益效果在于本发明的内毒素吸附介质不但对于内毒素具有较高的选择性，而且由于引入了磁性物质，吸附时也不需要装柱处理，待吸附平衡后外加磁场即可将吸附介质与样品分离，操作简便，可用于大量生物制品中内毒素的去除。
四
图1为实施例1所得吸附介质的扫描电镜图；图2为实施例1所得吸附介质的粒径分布图；图3为实施例1所得吸附介质的磁滞回归线图； 图4为实施例1磁性壳聚糖微球-组氨酸(MCM-His)吸附动力学曲线；图5为实施例1与实施例2所得不同内毒素吸附介质的吸附效果图。
五具体实施例方式下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此实施例1 壳聚糖-组氨酸内毒素吸附介质(MCM-His)的制备(1)将1. 5g四氧化三铁超声分散在IOOmL体积分数为2%的乙酸溶液中，加入3g 壳聚糖(奥兴公司生产，分子量30万，脱乙酰度95%，即氨基密度为5833ymol/g)使其完全溶解后分散到IOOmL含有ImL司盘80的液体石蜡中，搅拌30min后滴加3mL体积分数为 25%的戊二醛溶液，40°C反应池，用质量分数为10%的NaOH溶液调整pH至12左右，同时升温至70°C，继续搅拌反应2h，产物经石油醚和热乙醇洗涤后真空干燥，即得磁性壳聚糖微球(MCM)，采用酸碱滴定法测定其氨基密度取微球50mg分散至20ml 10mmol/L的盐酸溶液中，振荡反应lh，外加磁场吸住微球，取清液15ml用lOmmol/L氢氧化钠溶液滴定，计算后结果见表1。(2)将步骤(1)所得磁性壳聚糖微球1. Og分散到20mL 二甲亚砜与氢氧化钠的混合溶液(体积比1 1，氢氧化钠浓度为lrnol/L)中，加入3mL环氧氯丙烷，40°C振荡反应 4h后用去离子水洗涤至中性、干燥。(3)将步骤⑵所得产物0. 5g转移至IOmL 0. lmol/L组氨酸溶液中，用0. 5M氢氧化钠溶液将PH调整至11左右，40°C水浴振荡过夜，用去离子水洗涤至中性后干燥保存即得磁性壳聚糖-组氨酸内毒素吸附介质(MCM-His)，其氨基密度见表1，其扫描电镜图、粒径分布图、磁滞回归线图分别如图1、图2、图3所示。实施例2 壳聚糖-四乙烯五胺内毒素吸附介质(MCM-TEPA)的制备(1)将2. Og四氧化三铁超声分散在IOOmL体积分数为5%的乙酸溶液中，加入4g 壳聚糖(奥兴公司生产，分子量30万，脱乙酰度95%，即氨基密度为5833ymol/g)使其完全溶解后分散到200mL含有3mL司盘80的液体石蜡中，搅拌30min后滴加4mL体积分数为 25%的戊二醛溶液，40°C反应lh，用质量分数为10%的NaOH溶液调整pH至12左右，同时升温至70°C，继续搅拌反应3h，产物经石油醚和热乙醇洗涤后真空干燥，即得磁性壳聚糖微球。(2)将步骤(1)所得磁性壳聚糖微球0. 5g分散到IOmL 二甲亚砜与氢氧化钠的混合溶液(体积比1 1，氢氧化钠浓度为lrnol/L)中，加入3mL环氧氯丙烷，40°C振荡反应 4h后用去离子水洗涤至中性、干燥。(3)将步骤⑵所得产物0. 5g转移至IOmL 0. 2mol/L四乙烯五胺溶液中，用0. 5M 氢氧化钠溶液将PH调整至11左右，40°C水浴振荡过夜，用去离子水洗涤至中性后干燥保存即得磁性壳聚糖-四乙烯五胺内毒素吸附介质(MCM-TEPA)，其氨基密度见表1。表1不同吸附介质的氨基密度
吸附介质MCMMCM-HisMCM-TEPA氨基密度(μιηο /g)867.71240.11344.2实施例3 吸附介质的使用分别取磁性壳聚糖微球(实施例1制得的MCM)、磁性壳聚糖微球-组氨酸(实施例1制得的MCM-His)及磁性壳聚糖微球-四乙烯五胺(实施例2制得的MCM-TEPA) 50mg 用质量分数为1 %脱氧胆酸钠水溶液洗涤抽滤或磁场分离三次，再用无热原水洗涤三次，干燥后分散到2mL含有内毒素的溶液(自来水)中，振荡吸附30min，用磁铁吸住吸附介质，取出上清液测定内毒素含量。内毒素含量测定采用鲎试剂显色基质法，磁性壳聚糖微球-组氨酸(MCM-His)对内毒素的吸附动力学曲线如图4所示，不同吸附介质的吸附效果如图5所示，从图4可以看出该吸附介质的吸附平衡时间较短，在IOmin之内，可以高效快速的对样品进行去内毒素处理。从图5可以看出，磁性壳聚糖微球(MCM)本身对内毒素也存在一定吸附作用，因为虽然戊二醛与壳聚糖交联反应发生在醛基与氨基，但不可能完全，再加上微球本身的凝胶孔都会对内毒素产生一定的吸附作用。经过组氨酸和四乙烯五胺固载后吸附介质的吸附容量得到了提升，其中以四乙烯五胺为配基的吸附介质(MCM-TEPA)的吸附容量提高到了 554.lEU/go
权利要求
1.一种基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的内毒素吸附介质的制备方法包括如下步骤(1)先将磁性材料分散在乙酸溶液中，加入壳聚糖配成水相I，再将该水相I转移至含有司盘80的液体石蜡中，以戊二醛为交联剂，采用反相悬浮法制得磁性壳聚糖微球；所述的磁性物质为四氧化三铁或铁；(2)将磁性壳聚糖微球分散到二甲基亚砜与氢氧化钠的混合溶液中，再加入环氧氯丙烷活化，去离子水洗涤至中性，得到活化后产物；(3)将活化后产物置于内毒素亲和配基溶液中固载，即得到所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质；所述的内毒素亲和配基为组氨酸、精氨酸、多聚赖氨酸、多粘菌素B 或四乙烯五胺。
2.如权利要求1所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的步骤(1)具体按照如下进行将磁性材料超声分散到乙酸溶液中，加入壳聚糖后搅拌均勻得到水相I，水相I中壳聚糖的浓度为10 40g/L，乙酸浓度为10 50mL/L，磁性材料与壳聚糖的投料质量比为0.2 1 1 ；然后将水相I加入到含有0. 1 2Vol%司盘80的液体石蜡中，水相I与含有0. 1 2Vol%司盘80的液体石蜡的混合体积比为1 1 5 ；混勻后加入戊二醛，所加入的戊二醛与壳聚糖氨基的摩尔比为1 0.1 6，加毕调整温度至 25 50°C反应1 3小时，然后调整体系pH至10 13，同时升温至50 80°C，继续搅拌反应1 3小时，充分反应后分离产物，经洗涤、干燥得到磁性壳聚糖微球。
3.如权利要求2所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述步骤(1)中，水相I中壳聚糖浓度为30 40g/L。
4.如权利要求2所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述步骤(1)中，戊二醛与壳聚糖氨基的摩尔比为1 1 2。
5.如权利要求2所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述步骤(1)中，调整体系PH调至10 13以后，升温至70°C反应2 3小时。
6.如权利要求1所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的步骤( 具体按照如下进行将磁性壳聚糖微球分散到二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液中，然后加入环氧氯丙烷在振荡下于25 50°C进行活化反应，充分反应后过滤、洗涤至中性、干燥得到所述的活化后产物；所述二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液由二甲亚砜与0. 1 2mol/L 的氢氧化钠水溶液按照体积比1 0.25 5配制得到，所述环氧氯丙烷与二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液的投料体积比为1 50 100，磁性壳聚糖微球与环氧氯丙烷的投料质量体积比为lg/1 IOmL0
7.如权利要求6所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的步骤O)中，控制二甲亚砜/氢氧化钠混合溶液中氢氧化钠终浓度在0. 8 lmol/L。
8.如权利要求1所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的步骤(3)具体按照如下进行将活化后产物置于0. 1 0. 5mol/L内毒素亲和配基溶液中， 调节pH至10 12，于20 50°C振荡反应过夜，反应完毕后过滤、洗涤至中性、干燥即得所述的内毒素吸附介质。
9.如权利要求8所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质，其特征在于所述的步骤(3)中，所述活化后产物与0. 1 0. 5mol/L内毒素亲和配基溶液的质量体积比为~0. 1 lg/10mL。
10.如权利要求1所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质的使用方法，具体按照如下方法进行取内毒素吸附介质用脱氧胆酸钠水溶液洗涤，再用无热原水充分洗涤，干燥后分散到含有内毒素的待处理溶液中，充分振荡或搅拌，然后外加磁场吸住吸附介质，取出上清液即为处理后溶液。
全文摘要
本发明公开了一种基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质及其使用方法，所述的内毒素吸附介质的制备方法包括如下步骤(1)先将磁性材料分散在乙酸溶液中，加入壳聚糖配成水相I，再将该水相I转移至含有司盘80的液体石蜡中，以戊二醛为交联剂，采用反相悬浮法制得磁性壳聚糖微球；(2)将磁性壳聚糖微球分散到二甲基亚砜与氢氧化钠的混合溶液中，再加入环氧氯丙烷活化，去离子水洗涤至中性，得到活化后产物；(3)将活化后产物置于内毒素亲和配基溶液中固载，即得到所述的基于磁性壳聚糖微球的内毒素吸附介质。本发明的内毒素吸附介质不但对于内毒素具有较高的选择性，而且操作简便，可用于大量生物制品中内毒素的去除。
文档编号B01J20/30GK102350309SQ201110182649
公开日2012年2月15日 申请日期2011年6月30日 优先权日2011年6月30日
发明者姜玉奇, 应国清, 易喻, 来灿林, 梅建凤, 王鸿, 陈建澍 申请人:浙江工业大学