一种河豚毒素分子印迹整体柱的制备方法及整体柱和应用与流程

本发明属于高分子材料制备技术及其在河豚毒素分离分析中的应用，具体的说涉及一种新型河豚毒素的分子印迹整体柱。

背景技术：

河豚毒素(TTX)是一种小分子生物碱类的神经毒素。广泛存在于河豚等多种海洋脊椎动物、无脊椎动物体内或体表，是自然界毒性最强的非蛋白物质之一。河豚毒素对人体毒性极强，且无特效解救药物，在各国沿海分布广泛，已发生多起该类毒素造成的人员中毒死亡事件，受到人们的高度关注，是相关海产品食用安全的必检项目。

目前对海洋河豚毒素的检测方法有小白鼠生物试验法、高效液相色谱法、液质联用法、毛细管电泳法、酶联免疫法和细胞毒性测试方等。尽管河豚毒素的检测方法已经取得很多进展，但现行认可的官方方法为河豚毒素检测的柱后衍生液相色谱-荧光法。上述方法均采用溶剂提取待测物，在提取物中存在大量的基体和干扰物质。通过常规净化手段并不能消除基质对检测结果准确度的影响，因此需要开发一种新型的高选择性的样品前处理方法。

由于动物可食用组织样品的基质和组成相当复杂，分析物容易被干扰和隐蔽，因此，样品前处理方法已成为动物性食品残留检测分析中的关键步骤。在河豚毒素分析中应用较多的净化方法是固相萃取法，SPE是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，共萃物因其极性或者理化性质相似，通过多柱串联或者多种净化方式的组合并不能很好的消除共萃物带来的干扰，反而因净化步骤过多，而使一些目标物的回收率受到影响，因此，在样品预处理过程中需要高选择性的萃取介质。

分子印迹技术是指对特定目标分子(模板分子)及其结构类似物具有特异性识别的聚合物的制备与应用技术。分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)的制备一般采用本体聚合法，得到的聚合产物经研磨、过筛后在一定的溶剂条件下充分洗涤除去模板分子、致孔剂和未反应的单体等物质，进而得到对模板分子具有特殊识别作用的聚合物材料。该聚合物在复杂的体系中能选择性地识别模板分子，并具有抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点，已广泛用于样品前处理色谱分析。

整体柱，又称为棒状柱，是一种用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相。整体柱具有内部结构均匀、渗透率高、易改性和传质速率快等优点，可解决填充色谱柱空间占用率低、 传质速率慢、柱负压高、色谱峰拖尾严重等问题，被誉为第4代色谱固定相。

基于分子印迹聚合物的选择识别能力和整体柱的诸多优点，将二者相结合制备分子印迹整体柱(Molecularly imprinted monolithic colunln，MIPMC)成为必然的发展趋势。作为一种新型的固相萃取材料和色谱固定相，分子印迹整体柱已被广泛用于环境、生物、医药分析等领域。

技术实现要素：

本发明的目的是实现河豚毒素的特异性富集与检测。提供一种河豚毒素整体柱的制备方法，以及在高效液相色谱中河豚毒素的快速富集与检测。

在毛细管柱内制备分子印迹整体柱，并在液相色谱中实现了河豚毒素的快速富集与检测，该方法包括以下步骤：

(1)将河豚毒素标准品溶解在二甲亚砜溶液中，加入功能单体、交联剂、致孔剂，超声混合，通氮除氧，静置至少20min以形成稳定的复合物。

(2)加入引发剂占溶液总重量的0.5％～5％，超声溶解。

(3)将(2)灌注在经γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修饰的25～250μm id的石英毛细管中，封端。60～70℃水浴中聚合12-16小时

(4)将印迹柱连接到高效液相色谱上，利用溶剂冲洗致孔剂与模板分子，便可得到具有良好印迹效果的整体柱。

(5)通过高效液相色谱，使用印迹柱作为捕集柱与分析柱，实现河豚毒素的快速富集与检测。

其中：

(1)所述的致孔剂为十二醇、1,4-丁二醇的混合物，其物质量之比为10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9:或0:10。

(2)所述模板分子所占单体物质量的比例为1％、2％、5％、10％、20％，所用经经γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修饰的毛细管柱为内径25μm、50μm、75μm、100μm、150μm、200μm、250μm，聚合温度为60～70℃水浴，印迹整体柱长度5cm或10cm。

本发明的优点在于：在石英毛细管柱内制备了河豚毒素的分子印迹整体柱，分析速度快，溶剂用量少，分子识别性能好。

本发明制备的分子印迹整体柱具有良好的选择识别性和小的传质阻力，作为高效液相色谱微柱，可实现对河豚样品中河豚毒素的分离、富集与检测。

附图说明

图1为整体柱扫描电镜图。

图2为印迹整体柱柱压与流速关系图。

图3为印迹整体柱富集净化前后河豚样品图。

具体实施方式

实施例1

(1)首先将模板分子河豚毒素0.1μmol，甲基丙烯酸1.0μmol，十二醇18mg、1,4-丁二醇17mg，亚甲基双丙烯酰胺1.1μmol，二甲亚砜为30mg，偶氮二异丁腈0.04mg，超声溶解5分钟混匀，通氮除氧5分钟，灌注在经过γ-(甲基丙烯酰氧基)-三甲氧基硅烷修饰的25μm id的石英毛细管中，封端。60～70℃水浴中聚合12小时。聚合反应完成后采用高压液相色谱泵冲洗未反应的单体和模板分子，可得MIP1。

实例2

(2)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，10:0)其他同实施例1，可得MIP2。

实例3

(3)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，9:1)其他同实施例1，可得MIP3。

实例4

(4)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，8:2)其他同实施例1，可得MIP4。

实例5

(5)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，7:3)其他同实施例1，可得MIP5。

实例6

(6)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，6:4)其他同实施例1，可得MIP6。

实例7

(7)加入致孔剂(十二醇、1,4-丁二醇，5:5)其他同实施例1，可得MIP7。

图1为MIP1整体柱扫描电镜图；图2为MIP1整体柱应用图，其应用条件为当流动相(乙腈)流速从0.02ml/min增加到0.08ml/min时，整体柱的柱压降也相应从3.6Mpa线性提高到15.3Mpa。

图3为MIP1整体柱应用图，其应用条件为流动相体系为0.1％(v/v)甲酸5mM甲酸铵水溶液-乙腈(15∶85，v/v)，其他条件为流动相流速0.2mL/min，柱温30℃，检测波长为196nm。