本发明属于天然药物分离技术领域，具体涉及一种用于分离纯化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制备方法。
背景技术：
紫杉醇（Paclitaxel）是目前已发现天然抗癌药物的重要代表，在临床上已广泛用于乳腺癌、卵巢癌和其他部位实体肿瘤的治疗。1992年，美国FAD（食品和药物管理局）批准紫杉醇上市，商品名Taxol，主要用于卵巢癌的治疗。紫杉醇最初是由美国化学家Wani等于1971年从红豆杉属植物短叶红豆杉树皮中提取出来的一种二萜类化合物。全球范围内，天然红豆杉被认为是天然珍稀抗癌植物，种类和数量稀少，生长缓慢，植物体内药用有效成分含量极低。在我国，许多地方在人工种植含量较高的杂交品种曼尼亚红豆杉（Taxus media），以满足市场需求。
介孔硅吸附材料是近些年来兴起的受科研工作者青睐的一种材料。无机改性介孔材料是一种表面改性材料，由于其高比表面积和优良的吸附性能，引起科学工作者的很大兴趣。本申请采用普通球形二氧化硅作为支撑体，在其表面进行改性，制备表面介孔和氨基改性的二氧化硅，并可用于分离和纯化紫杉醇。普通硅改性作为支撑体，使改性硅球具备良好的物理稳定性，表面介孔结构使其具有高比表面积，表面氨基改性使其对紫杉醇具有良好的选择性吸附能力。所以，本申请制备的一种氨基改性介孔二氧化硅可表现出良好的物理化学耐受力，使用寿命长，在合适的环境温度下可重复使用等特点。在药物分离纯化，化学催化及生物科技等方面有着广阔的应用前景。
在文献或专利中已经多种纯化分离紫杉醇的方法报道，如中国专利“申请号201310251956.4、201410388561.3”都有采用硅胶、碱性氧化铝柱层析或重结晶的手段来提取分离紫杉醇。据所查文献，还未发现有专利和文献与本发明相同。本发明的优点：在球形二氧化硅的基底上，将功能化基团与介孔结构相结合，制备氨基改性介孔二氧化硅，它可用于柱层析技术上，将紫杉醇的纯度提高近20倍，回收率达到80%以上，为紫杉醇工业化大规模生产提供一个方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种用于分离纯化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制备方法。
一种用于分离纯化紫杉醇的氨基改性介孔二氧化硅的制备方法，工艺过程包括以下步骤：
(1) 取10g球形二氧化硅（20-300目）加入到10-100mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗5-10遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
(2) 氮气气氛条件下，1.5-3.5mL含氨基的硅烷作为功能化试剂溶于10-100mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌1-6h，0.1-0.9g表面活性剂作为软模板，取1.0g经活化的二氧化硅和0.5-2.5mL正硅酸乙酯或正硅酸甲酯或它们的混合物加入到体系中。1mol/L 的催化剂溶液3-7mL逐滴加入，氮气气氛条件下保持50℃搅拌1-2h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化1-12h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
(3) 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分别洗涤3-10次，以除去表面活性剂，洗涤后，后60℃下真空干燥6-12h得氨基改性的介孔二氧化硅。
(4)将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体。
所述含氨基的硅烷是3-氨丙基-三甲氧基硅烷，3-氨丙基-三乙氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷中的一种或它们的混合物。
所述表面活性剂是Pluronic F127、Pluronic P123、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）中的一种或它们的混合物。
上述所述催化剂是酸（盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸中的一种或它们的混合物），或碱（NH4OH、三乙胺、NaOH中的一种或它们的混合物）。
上述制备的新型功能化二氧化硅材料，可应用于紫杉醇的分离纯化。
本发明提供的方法制备的氨基改性介孔二氧化硅材料对紫杉醇表现出良好的选择性吸附性能，经柱层析技术，浸膏样品中的紫杉醇含量可大幅度提升。采用该方法制备的氨基改性介孔硅材料，原料成本廉价，制备工艺和分离目标物的工艺操作简单，而且产率高，易于大规模地应用于工业生产。
具体实施方法
实施例1：
① 取10g球形二氧化硅（20目）加入到10 Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗5遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
② 氮气气氛条件下，功能化试剂(3-氨丙基-三乙氧基硅烷)1.5mL溶于10mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌1h。 0.1g表面活性剂Pluronic F127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）0.5mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂HCl3.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌1h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化1h。冷却至室温，过滤后由无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分别3次洗涤，以除去Pluronic F127，过滤后真空干燥6h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为9.0%，紫杉醇回收率为89%。
实施例2：
① 取10g球形二氧化硅（300目）加入到10 Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗10遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
②氮气气氛条件下，功能化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷3.5mL溶于50mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。0.59表面活性剂CTAB，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）2.5mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂NH4OH 7.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌2h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化12h。冷却至室温，过滤后由无水乙醇浮选，得大小均一的微球。
③ 上一步得到微球用去离子水、无水乙醇分10次洗涤，以除去CTAB，过滤后60℃下真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为8.2%，紫杉醇回收率为92%。
实施例3：
① 取10g球形二氧化硅（200目）加入到50mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗8遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
②氮气气氛条件下，功能化试剂N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷2.5mL溶于50mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。 0.5g表面活性剂PluronicF127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂HCl5.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌2h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化7h。冷却至室温，过滤后由无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的产物用去离子水、无水乙醇分5次洗涤，以除去PluronicF127，过滤后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为8.9%，紫杉醇回收率为80%。
实施例4：
① 取10g球形二氧化硅（180目）加入到60mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗7遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
②氮气气氛条件下，功能化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷2.0mL溶于40mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。 0.5g表面活性剂Pluronic P123/Pluronic F127混合物（1/1，g/g），1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯/正硅酸甲酯的混合物（1/1，mL/mL）1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂三乙胺4.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌2h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化12h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分5次洗涤，以除去表面活性剂，过滤后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为8.8%，紫杉醇回收率为86%。
实施例5：
① 取10g球形二氧化硅（100目）加入到70mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗6遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
② 氮气气氛条件下，功能化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷/3-氨丙基-三乙氧基硅烷混合物（1/1, v/v）2.0mL溶于50mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。0.5g表面活性剂Pluronic F127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸甲酯1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂HCl4.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌12h。冷却至室温，过滤后由无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分8次洗涤，以除去Pluronic F127，过滤后真空干燥10h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为6.5%，紫杉醇回收率为94%。
实施例6：
① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
② 氮气气氛条件下，功能化试3-氨丙基-三乙氧基硅烷剂2.5mL溶于100mL的无水乙醇，该混合溶液65℃搅拌6h。 0.5g表面活性剂F127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂硝酸3.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持65℃搅拌2h，之后保持65℃放入摇床震荡孵化7h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分别洗涤8次，以除去表面活性剂，洗涤后，后60℃下真空干燥8h得氨基改性的介孔二氧化硅。
④ 将所制备的改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为7.8%，，紫杉醇回收率为85%。。
实施例7：
① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
② 氮气气氛条件下，功能化试3-氨丙基-三乙氧基硅烷剂2.5mL溶于50mL的乙腈，该混合溶液65℃搅拌6h。 0.5g表面活性剂Pluronic F127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂HCl和乙酸混合物（1/1，v/v）4.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持65℃搅拌2h，之后保持65℃放入摇床震荡孵化12h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分5次洗涤，以除去Pluronic F127，过滤后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为5.3%，紫杉醇回收率为91%。
实施例8：
① 取10g球形二氧化硅（120目）加入到80mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗9遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
②氮气气氛条件下，功能化试3-氨丙基-三乙氧基硅烷剂2.5mL溶于50mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。0.5g表面活性剂F127，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯（TEOS）1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂NaOH4.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌2h，之后装入100mL聚四氟乙烯瓶中保持100℃放入摇床震荡孵化12h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分别洗涤6次，以除去表面活性剂，洗涤后，后60℃下真空干燥6h得氨基改性的介孔二氧化硅。
④ 将所制备的改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为6.3%，紫杉醇回收率为87%。
实施例9：
① 取10g球形二氧化硅（80目）加入到60mL Piranha溶液（过氧化氢：浓硫酸=3/7，v/v）中，加转子搅拌，油浴120℃，60min。冷却至室温，用乙醇稀释Piranha溶液（此时浓硫酸可能放热），冷却后过滤，用乙醇反复冲洗6遍，洗至中性即可。60℃下真空干燥12h，得到活化的二氧化硅，备用。
②氮气气氛条件下，功能化试剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷2.0mL溶于40mL的无水乙醇，该混合溶液50℃搅拌6h。 0.5g表面活性剂Pluronic P123，1.0g经活化的二氧化硅，正硅酸乙酯/正硅酸甲酯的混合物（1/1，mL/mL）1.0mL加入到体系中。1mol/L 的催化剂NaOH/NH4OH混合物（1/1, v/v）4.0mL逐滴滴加，氮气气氛条件下保持50℃搅拌2h，之后保持50℃放入摇床震荡孵化12h。冷却至室温，过滤后由用无水乙醇浮选后，得大小均一的微球。
③ 上一步得到的微球用去离子水、无水乙醇分5次洗涤，以除去表面活性剂，过滤后真空干燥12h得氨基改性介孔二氧化硅。
④ 将所制备的氨基改性介孔硅球，装载成一根小柱，干法上样对红豆杉粗提浸膏（紫杉醇含量0.4%）进行柱层析。利用乙醇/水梯度洗脱，收集不同流份，回收溶剂得固体，固体经HPLC检测紫杉醇纯度为8.1%，紫杉醇回收率为88%。