生物处理吸附澄清剂及其制备和使用方法与流程

本发明涉及适用于生物处理程序的吸附澄清剂。本发明还涉及制备和使用用于在生物处理程序过程中除去或分离不需要的生物物质的吸附澄清剂的方法。

背景技术：

近年来，已证实生物药物生产在mab产量上有重大提高，表现出高达25g/l的产品滴度，这通常与非常高的细胞密度相关。含有＞1.5亿个细胞/ml的高密度细胞培养物对于进一步的下游处理产生了巨大的挑战，因为需要除去大量的生物质和来自在细胞培养和收获期间产生的细胞碎片的提高的污染物水平。生物物质(特别地为mab)的制备通常涉及处理复杂的细胞培养发酵液，必须从其中分离和纯化所需的生物物质，同时保持高的总产物回收率和质量。传统上，离心以及过滤技术的组合(切向流过滤和深度过滤)已被广泛接受作为用于澄清这些复杂的细胞培养发酵液的重要工具。然而，哺乳动物细胞培养方法的改善提供了远远超过对于cho细胞为20×10⁶细胞/ml至对于per.c6细胞为＞150×10⁶细胞/ml的传统水平的总细胞密度。因此，由这样的收获物的高(≤40％)固体含量限制离心和过滤技术是明显的。

例如，离心可应用于处理具有高固体含量的进料流。然而，由于粒料体积的提高并且需要频繁疏导(特别是在大规模连续离心的情况下)，产物回收率可能是低的。此外，由离心过程中产生的剪切力引起的细胞破裂可进一步降低收获物的澄清效率，并且可能导致产物损坏和/或截留。

深度过滤器是有利的，因为它们除去污染物，并且许多是单次使用的规格，从而减少了清洁和验证的需要。然而，深度过滤器目前无法处理高固体进料流，并且经常与离心串联使用。tff可以处理高固体负载，但是由于在处理高密度进料流时在膜表面处固体的极化，这种技术可能表现出差的产率。由剪切力引起的过度的产物稀释和细胞裂解也会限制tff的实用性。

细胞培养收获物的絮凝也被广泛用于提高澄清通过量和增强下游过滤操作。目前的技术包括使用可溶性聚离子聚合物(诸如deae葡聚糖、基于丙烯酰基聚合物和聚乙烯胺)以及无机材料诸如硅藻土和珍珠岩，其除去细胞和细胞碎片。但是，聚合物必须随后从工艺流中除去，这需要通过工艺中和产物释放测定来监测和定量。如果下游工艺中包括1ex色谱法作为纯化步骤，则结合能力将受到絮凝剂带电性质的极大影响。聚阳离子储备溶液的高粘度提出了另外的工艺挑战。

近年来，已开发了各种新的澄清技术。例如，(http://www.selectscience.net/product-news/sartorius-stedim-biotech)已经引入了使用硅藻土(de)作为助滤剂的用于高细胞密度培养物的单次使用收获技术。(minowb.等人，bioprocessint.，2014年4月1日)。但是，由于de的低表面积(bet约1m²/g)和无孔性质，其在吸附蛋白质和/或其它类型的生物制剂方面没有作用，而仅作为助滤剂。

在其它工艺中，官能化的颗粒材料已被用作澄清细胞发酵液的吸附剂。例如通过在工艺中利用阴离子交换材料来澄清或除去宿主细胞蛋白的wo2010043700和wo2010043703方法。该专利申请中没有描述离子交换材料的性质或最佳条件。

持续努力以进一步开发澄清材料和具有官能化颗粒材料形式的改进试剂的工艺，以便提高结合能力(即可与吸附澄清剂结合的生物材料的量和种类)和/或官能化颗粒材料的结合选择性。

技术实现要素：

本发明通过发现某些官能化多孔无机氧化物材料作为澄清吸附剂提供了增强的性能的用途，从而解决了本领域对改进的生物工艺的需求。与已知的官能化颗粒物质相比，本发明的吸附剂出乎意料地提供了优异的结合能力以及在生物工艺(例如，生物纯化、生物分离等)中的结合选择性。

具体地，本发明提供了采用由多孔无机氧化物颗粒组成的聚合物官能化无机氧化物材料的改进的生物处理，该多孔无机氧化物颗粒具有足够宽的孔径分布，使得所述颗粒能够选择性地结合多种生物分子(包括但不限于：细胞、宿主细胞蛋白、核酸、细胞碎片、染色质等)，以便在一个或多个生物处理步骤中除去这些物质。在一些实施方案中，多孔无机氧化物颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的至少约1.0的孔径分布。在其它实施方案中，其中多孔颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的高达约5.0至约10.0的孔径分布。

因此，本发明涉及用作各种生物工艺中的澄清剂的具有特定孔径分布的聚合物官能化多孔无机氧化物颗粒(在本文中也称为“吸附剂”)。在一个示例性实施方案中，本发明涉及包含与多孔无机氧化物颗粒的表面共价键合的聚合物材料的吸附剂，其中所述颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的至少约1.0的孔径分布。在一些期望的实施方案中，本发明包括用作生物处理澄清剂的吸附剂，其中该吸附剂包含与多孔无机氧化物颗粒的表面共价键合的聚电解质材料，其中该多孔颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的高达约5.0至约10.0的孔径分布。在本发明的优选实施方案中，聚合物材料包括聚电解质，例如聚亚乙基亚胺。在本发明的甚至更优选的实施方案中，多孔金属氧化物颗粒包括二氧化硅。

本发明甚至还涉及制备官能化颗粒材料形式的吸附剂的方法。在一个示例性实施方案中，制备本发明的吸附剂的方法包括：在使得至少一种聚合物材料与金属氧化物颗粒的至少一个表面共价键合的反应条件下使多孔无机金属氧化物颗粒与一种或多种反应物接触，其中该金属氧化物颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的至少约1.0的宽孔径分布。

本发明还涉及在生物处理程序过程中澄清生物处理混合物的方法。该方法通过使用本发明的吸附剂从生物处理混合物中除去或分离不需要的生物物质，例如细胞碎片。

在研读了下面所公开的实施方案的详细描述和所附权利要求之后，本发明的这些以及其它特征和优点将变得明确。

附图说明

附图以图形方式示出了两种不同二氧化硅的孔径分布(来自压汞法)的比较。

详细描述

为了促进对本发明原理的理解，下文将对本发明的具体实施方案进行说明，并且使用特定的语言来描述具体实施方案。然而应当理解，使用特定的语言并不旨在限制本发明的范围。本发明所属领域的普通技术人员通常可以设想所述的本发明原理的变型、进一步修改以及更进一步应用。

必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“一种氧化物”包括多种此类氧化物，并且提及“氧化物”包括本领域技术人员已知的一种或多种氧化物及其等同物，等等。

在描述本公开的实施方案时所采用的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、工艺温度、工艺时间、回收率或产率、流速和类似值及其范围的“约”是指可能例如通过典型的测量和处理程序；通过这些程序中无意的错误；通过用于实施方法的成分的差异；和类似的注意事项产生的数量上的变化。术语“约”还涵盖因具有特定初始浓度或混合物的制剂老化而变化的量，以及由于混合或处理具有特定初始浓度或混合物的制剂而变化的量。无论是否由术语“约”修饰，所附权利要求都包括这些数量的等同形式。

如本文所用，术语“生物工艺”或“生物处理”是指形成、改变和/或利用一种或多种生物分子的分批工艺。术语“生物工艺”包括但不限于生物分离工艺、生物纯化工艺、形成生物药物的工艺以及纯化生物药物的工艺。如本文所用，术语“生物工艺”或“生物处理”是指可在色谱工艺之前进行的处理(例如，从一批物质中除去细胞碎片)，不包括色谱工艺(例如液相色谱法)。

如本文所用，术语“生物分子”是指由活生物体产生的任何分子，包括：大分子诸如蛋白质、多糖、脂质和核酸；以及小分子诸如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。生物分子的实例包括：细胞和细胞碎片；抗体、蛋白质和肽；核酸，诸如dna和rna；内毒素；病毒；疫苗等。生物分子的其它实例包括在wo2002/074791和u.s.5,451,660中列举的那些。

如本文所用，“多孔无机金属氧化物颗粒”包括由具有颗粒内孔隙或颗粒间孔隙(较小颗粒凝聚形成较大颗粒的情况下)的无机金属氧化物材料组成的颗粒。无机金属氧化物包括但不限于二氧化硅、氧化铝、氧化锆、或它们的组合。

如本文所用，当涉及无机氧化物颗粒的表面时，术语“官能化”意指已通过与至少一种官能化合物反应以改变颗粒表面(包括颗粒外部的表面区域和/或内部孔隙的表面区域)的至少一部分的选择性来表面改性的多孔无机金属颗粒。颗粒的官能化表面可用于形成键合相(共价地或离子地)、涂覆表面(例如，反相c18键合)、聚合表面(例如，离子交换)、固有表面(例如无机/有机杂化材料)等。例如，使多孔无机氧化物颗粒与十八烷基三氯硅烷反应通过硅烷与无机表面(例如，c4、c8、c18等)的共价键合来形成“反相”。在另一个实例中，使无机颗粒与氨基丙基三甲氧基硅烷反应，随后氨基季铵化形成“阴离子交换相”。在第三实例中，键合相可以通过使无机颗粒与氨基丙基三甲氧基硅烷反应，然后与酰氯形成酰胺而形成。其它键合相包括二醇、氰基、阳离子、亲和性、手性、氨基、c18、亲水相互作用(hilic)、疏水相互作用(hic)、混合模式、尺寸排阻等。作为键合相或官能化表面的一部分，配体可用于表明与靶分子或生物分子(例如连接物)的特异性相互作用，诸如u.s.4,895,806中所述的那些。

如本文所用，术语“聚电解质”被定义为意指包含重复单元的聚合物，所述重复单元诸如(i)阳离子、(ii)阴离子或(iii)与水性溶液中的质子缔合或解离形成正电荷或负电荷的电解质官能团。例如，适用于本发明的阳离子聚电解质包括但不限于聚亚乙基亚胺(pei)、聚烯丙基胺、聚乙烯基吡啶、聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdadmac)和含有相似官能团的共聚物。适用于本发明的阴离子聚电解质包括但不限于聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、核酸和含有相似官能团的共聚物(例如，聚(苯乙烯-共聚-马来酸)、聚(苯乙烯磺酸-共聚-马来酸))。

如本文所用，术语“聚亚乙基亚胺”被定义为意指包含与-ch2ch2-间隔物键合的胺的重复单元的聚合物，其中所述聚合物可以是线性或支化的并且可包含伯、仲和/或叔氨基。

如本文所用，术语“bet颗粒表面积”被定义为意指通过brunaueremmetteller氮吸附法所测得的颗粒表面积。

如本文所用，术语“中值孔径(尺寸)分布”使用可得自micromeriticsinstrumentcorporation(norcross，ga)的iv9520通过压汞法进行测量。

如本文所用，术语“孔径分布”意指在多孔无机颗粒的代表性体积中各孔径的相对丰度。

如本文所用，“中值孔径”是中值孔径(pd50)，其被定义为50％的孔体积由较小的孔隙贡献和50％由较大的孔隙贡献的中点。

如本文所用，本文中提及的术语“孔体积”表示来自将汞注入到50至尺寸孔隙的累积体积。

如本文所用，术语“分子量”被定义为意指特定化合物或聚合物的单分子的摩尔质量。

如本文所用，“孔径分布跨度90值”计算为[(pd90-pd10)/pd50]，其中pd10是在10％累积孔体积贡献下的孔径，pd50是在50％累积孔体积贡献下的孔径，pd90是在90％累加孔体积贡献下的孔径，所有基于压汞法数据。

多孔颗粒

如上所述，用于制备本发明吸附剂的多孔无机金属氧化物颗粒具有如通过孔径分布跨度90值测得的至少约1.0(或至少约2.0、或至少约3.0、或至少约4.0、或至少约5.0、或至少约6.0、或至少约7.5、合意地约5.0至约10.0、更合意地约7.5至约8.5，并且在一些实施方案中，约7.8)的宽孔径分布。宽孔径分布使得能够形成提供优异结合能力、结合选择性以及结合多种生物分子的吸附澄清剂。

一般来讲，多孔无机金属氧化物颗粒具有约30至约的孔径分布。

有利地，用于形成本发明的吸附剂的多孔无机金属氧化物颗粒的宽孔径分布通过选择以下来实现受控的结合能力、结合选择性和结合多种生物分子：(1)与金属氧化物颗粒的表面结合的特定聚合物材料、(2)与金属氧化物颗粒的表面结合的聚合物材料的量和/或(3)与金属氧化物颗粒的表面结合的聚合物材料的分子量。如以下实施例部分所示和所讨论的，当与已知的市售吸附剂相比时，用于形成本发明的吸附剂的金属氧化物颗粒的宽孔径分布提供了更大的灵活性和结合能力。

通常，用于制备本发明的吸附剂的多孔金属氧化物颗粒具有至少约的中值孔径。在另一个实施方案中，多孔无机颗粒具有至少约(或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约或至少约)的中值孔径。在一些实施方案中，多孔无机颗粒具有约至约的中值孔径。在一些实施方案中，多孔无机颗粒具有约至约的中值孔径。在其它实施方案中，多孔无机颗粒具有小于的中值孔径。在其它实施方案中，多孔无机颗粒具有小于的中值孔径。

金属氧化物颗粒通常具有如通过中值颗粒尺寸测得的小于150μm的粒度。多孔无机金属氧化物颗粒通常具有约1μm，更典型地小于约100μm的中值颗粒尺寸。在一些实施方案中，多孔无机颗粒具有约10至约50μm，更合意地约30μm的中值颗粒尺寸。

通常，金属氧化物颗粒通常具有不规则形状，但可具有任何形状(例如，球形、椭圆形等)。无论形状如何，多孔无机金属氧化物颗粒通常具有如上所述的中值颗粒尺寸。

在另外的实施方案中，多孔无机金属氧化物颗粒可具有如例如使用透射电子显微镜(tem)技术测得的至少约1.0的纵横比。如本文所用，术语“纵横比”用于描述(i)多孔无机颗粒的中值颗粒尺寸与(ii)多孔无机颗粒的中值截面颗粒尺寸之间的比率，其中所述截面颗粒尺寸基本垂直于多孔无机颗粒的最大颗粒尺寸。在本发明的一些实施方案中，多孔无机颗粒具有至少约1.1(或至少约1.2、或至少约1.3、或至少约1.4)的纵横比。通常，多孔无机颗粒具有约1.0至约1.5的纵横比。

通过将汞注入到50至尺寸孔隙中来测量多孔无机金属氧化物颗粒的孔体积。在另一个实施方案中，如通过将汞注入到50至尺寸孔隙中所测得的，多孔无机金属氧化物颗粒的孔体积为至少约0.25cc/g至0.50cc/g。在本发明的一个示例性实施方案中，如通过将汞注入到50至尺寸孔隙中所测得的，多孔无机颗粒具有至少约1.0cc/g、至少约1.50cc/g或至少约1.77cc/g的孔体积。在本发明的另一个示例性实施方案中，如通过将汞注入到50至尺寸孔隙中所测得的，多孔无机颗粒具有约1.0cc/g至约3.0cc/g的孔体积。

多孔无机金属氧化物颗粒的表面积还具有如通过bet氮吸附法(即brunaueremmetteller方法)所测得的至少约100m²/g、或至少约300m²/g、或至少约500m²/g的表面积。在本发明的一个示例性实施方案中，多孔无机氧化物颗粒具有约100m²/g至约1000m²/g、或600m²/g至约800m²/g的bet表面积。在本发明的又一个示例性实施方案中，多孔无机氧化物颗粒具有约700m²/g的bet表面积。

用于制备本发明的吸附剂的多孔无机金属氧化物颗粒可包括多种无机材料，包括但不限于二氧化硅、氧化铝、氧化锆、或它们的混合物。在一个期望的实施方案中，金属氧化物颗粒包括二氧化硅。当金属氧化物颗粒包括二氧化硅时，基于颗粒的总重量计，颗粒合意地包括具有至少约93重量％sio2、或至少约93重量％sio2、至少约94重量％sio2、至少约95重量％sio2、至少约96重量％sio2、至少约97重量％sio2、或至少约98重量％sio2、至多100重量％sio2的纯度的二氧化硅。

吸附剂

根据本发明，吸附剂包含如上所述的多孔金属氧化物颗粒和与所述金属氧化物颗粒的表面共价键合的聚合物材料。在一个实施方案中，吸附剂包含从所述金属氧化物颗粒的所述表面延伸的至少一个双官能部分，所述至少一个双官能部分中的每一个包含(i)能够与所述表面键合的一个或多个官能团，以及(iia)所述聚合物材料或者(iib)能够与所述聚合物材料键合的一个或多个反应性基团。

在另一个实施方案中，吸附剂包含从所述金属氧化物颗粒的表面延伸的至少一个双官能部分，所述至少一个双官能部分中的每一个包含(i)能够与所述表面键合的一个或多个官能团，以及(iia)所述聚合物材料。

在又一个实施方案中，吸附剂包含从所述金属氧化物颗粒的所述表面延伸的至少一个双官能部分，所述至少一个双官能部分中的每一个包含(i)能够与所述表面键合的一个或多个官能团，以及(iib)能够与所述聚合物材料键合的一个或多个反应性基团。

从所述金属氧化物颗粒的表面延伸的合适的双官能部分包含可与来自聚电解质的聚合物链的胺基团反应的环氧环。在一个实施方案中，包含在吸附剂中的至少一个双官能部分包括金属氧化物表面与环氧硅烷反应的产物。在一个优选的实施方案中，环氧硅烷包括(3-缩水甘油氧基丙基)-三甲氧基硅烷。

在本发明的一个实施方案中，聚合物材料通过由选自c、o、si和n的一个或多个原子组成的共价键连接与金属氧化物颗粒的表面共价键合。

通常，聚合物材料包括聚电解质。聚电解质可以是阳离子的或阴离子的。合适的阳离子聚电解质材料包括聚亚乙基亚胺、聚烯丙基胺、聚乙烯基吡啶、聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdadmac)、含有一个或多个阳离子或阳离子形成性官能团的共聚物、或它们的组合。阳离子聚电解质还可以包括所述金属氧化物颗粒与三甲氧基甲硅烷基-聚亚乙基亚胺水性溶液的反应产物。在优选的实施方案中，聚合物材料包括聚亚乙基亚胺。在甚至更优选的实施方案中，聚亚乙基亚胺具有(i)重均分子量mw和(ii)数均分子量mn，它们各自小于约5000。在又一个更优选的实施方案中，聚亚乙基亚胺具有(i)重均分子量mw和(ii)数均分子量mn，它们各自在约500至约2500的范围内；或者(i)在约800至约2000范围内的重均分子量mw，和(ii)在约600至约1800范围内的数均分子量mn。

在一个实施方案中，在与所述表面共价键合之前，聚合物材料包括具有以下结构的聚亚乙基亚胺：

并且n为大于或等于1的数字。

合适的阴离子聚电解质材料包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、核酸、含有一个或多个阴离子或阴离子性形成官能团的共聚物、或它们的组合。在一个优选的实施方案中，阴离子聚电解质材料包括聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、或它们的组合。在一个更优选的实施方案中，阴离子聚电解质材料包括重均分子量mw大于约50,000的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸。在一个甚至更优选的实施方案中，聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸具有约100,000至约250,000的重均分子量mw。

吸附剂中存在的聚合物材料的量是适于提供与生物制剂的电荷相互作用并因此与相反电荷的这些生物制剂选择性结合的任何量。在一个实施方案中，聚合物材料具有使得金属氧化物颗粒的少于100％的所述表面与所述聚合物材料键合的量。在另一个实施方案中，所述聚合物材料以占基于所述吸附剂的总重量计所述吸附剂的最多约20.0重量％的量存在于吸附剂中。在其它实施方案中，聚合物材料以占基于所述吸附剂的总重量计所述吸附剂的约1.0至约15.0重量％的量存在。

在本发明的优选实施方案中，包含在吸附剂中的多孔金属氧化物颗粒包括二氧化硅颗粒。

制备吸附剂的方法

本发明的吸附剂通常通过在使得聚合物材料与金属氧化物颗粒的表面共价键合的反应条件下使金属氧化物颗粒与一种或多种反应物接触来制备。接触步骤可利用溶剂。在一个实施方案中，接触步骤利用不含有机溶剂的反应混合物。

在本发明的一个实施方案中，所述一种或多种反应物包括至少一种双官能化合物，所述双官能化合物包含(i)能够使化合物与金属氧化物颗粒的表面键合的一个或多个官能团，以及(iia)聚合物材料或者(iib)能够与聚合物材料键合的一个或多个反应性基团。

包括至少一种双官能化合物的合适的反应物包含(i)能够使化合物与金属氧化物颗粒的表面键合的一个或多个官能团，以及(iia)聚合物材料，包括但不限于聚亚乙基亚胺。

包括至少一种双官能化合物的合适的反应物包含(i)能够使化合物与金属氧化物颗粒的表面键合的一个或多个官能团，以及(iib)能够与聚合物材料键合的一个或多个反应性基团，包括不限于聚丙烯酸。

选择所述一种或多种反应物以便产生通过由于相反电荷的吸引而对一种或多种特定生物化合物具有期望程度的亲和力的吸附剂也在本发明的范围内。例如，带负电荷的dna对带正电荷表面的亲和力。还可以选择所述一种或多种反应物中的每一种的量，以便形成具有由聚合物材料产生的期望程度的颗粒表面覆盖度的吸附剂。

吸附剂的用途

根据本发明的吸附剂包含用聚电解质官能化的多孔无机金属氧化物表面。为了实现较高量的不需要的生物物质的吸附，对多孔分子的需求是高孔体积(＞1.0cc/g)和高孔径分布跨度90值(＞1.0)。如果满足这些条件，在与带正电荷或带负电荷的聚电解质键合的情况下，吸附材料可以有效地用作吸附剂和澄清剂两者。在一个实施方案中，官能化吸附剂用作生物处理澄清剂，其中所述吸附剂包含：具有如通过孔径分布跨度90值测得的至少约1.0的宽孔径分布的金属氧化物颗粒；和与金属氧化物颗粒的表面共价键合的聚合物材料。

可通过以下操作来使用吸附剂：在生物处理容器中接触官能化多孔吸附剂，所述生物处理容器含有在生物处理程序中获得的不需要的生物制剂；允许足够的温育时间以允许不需要的生物制剂吸附到吸附剂上或形成细胞团块和上清液层；通过过滤或滗析分离所得混合物，或者抽出上清液层，然后从滤液或上清液中提取所需的生物物质，或者进行进一步的纯化步骤，包括深度过滤和下游色谱步骤。

在一个实施方案中，将根据本发明的吸附剂添加到含有一种或多种生物分子的生物处理容器中，所述生物分子选自蛋白质、多糖、脂质、核酸、代谢物、哺乳动物细胞、哺乳动物细胞碎片、抗体、肽、dna、rna、内毒素、病毒、疫苗、酶、或它们的任意组合。在其它实施方案中，生物处理容器含有以下中的至少一种：宿主细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、核酸、染色质、抗体、病毒或疫苗。官能化吸附剂与一种或多种与所述吸附剂接触的生物分子结合。在吸附剂与一种或多种与所述吸附剂接触的生物分子结合的结合步骤之后，将与一种或多种生物分子结合的吸附剂与生物处理程序的其它组分分离。

应当理解，尽管上述吸附剂和方法被描述为“包括”一个或多个组分或步骤，但是上述吸附剂和方法可以“包括”、“由以下组成”或“基本上由以下组成”：吸附剂和方法的上述组分或步骤中的任一者。因此，在本发明或其一部分已经用诸如“包括”的开放式术语进行描述的情况下，应当容易地理解(除非另有指出)，对本发明或其一部分的描述也应被解释为使用术语“基本上由...组成”或“由...组成”或如下所述的其变型形式来描述本发明或其一部分。

如本文所用，受到另外明确指出的限制，术语“包含(comprise/comprising)”、“包括(include/including)”、“具有(have/having)”、“含有(contain/containing)”、“特征在于”或其任何其它变型形式旨在涵盖所列举的组分的非排他性包含。例如，“包括”一系列要素(例如，组分或步骤)的吸附剂和/或方法不一定仅限于那些要素(或组分或步骤)，而是可以包括没有明确列出或所述吸附剂和/或方法所固有的其它要素(或组分或步骤)。

如本文所用，过渡性短语“由...组成(consistof/consistingof)”排除未指定的任何要素、步骤或组分。例如，权利要求中使用的“由...组成”将权利要求限制在所述权利要求中所具体列举的组分、材料或步骤，除通常与之相关的杂质(即给定组分中的杂质)之外。当短语“由...组成”出现在权利要求的主体的从句中而不是紧接在前序之后时，短语“由...组成”仅限制该从句中所述的要素(或组分或步骤)；其它要素(或组分)并不排除在作为整体的权利要求之外。

如本文所用，除字面上公开的那些以外，过渡性短语“基本上由...组成(consistessentiallyof/consistingessentiallyof)”用于限定包括材料、步骤、特征、组分或要素的吸附剂和/或方法，前提条件是那些附加的材料、步骤、特征、组分或要素不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新型特征(一个或多个)。术语“基本上由...组成”占据“包括”和“由...组成”之间的中间地带。

此外，应当理解，本文所述的吸附剂和/或方法可包括、基本上由以下组成或由以下组成：本文所述的任何组分和特征中的任一者，如具有或不具有附图中未示出的任何特征(一个或多个)的附图所示。换句话讲，在一些实施方案中，本发明的吸附剂和/或方法不具有除附图中所示的那些之外的任何附加特征，并且附图中未示出的这样的附加特征被明确排除在所述吸附剂和/或方法之外。在其它实施方案中，本发明的吸附剂和/或方法具有附图中未示出的一个或多个附加特征。

以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例不应以任何方式被解释为对本发明的范围施加限制。相反，应当清楚地理解，在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，本领域的技术人员在阅读本文的描述之后可认识到，可以采取各种其它实施方案、修改和其等同形式。

实施例

使用可得自马尔文仪器有限公司(malverninstrumentltd.)的malvernmastersizer2000通过激光散射测定中值粒度(根据astmb822-10)。粒度通过体积分布被定义为中值粒度。bet表面积由文献中所述的氮吸附分析方法获得。中值孔径、孔体积和孔径分布根据将汞注入到35至尺寸孔隙中来计算。孔体积被定义为相同孔径范围内的累积孔体积，并且中值孔径是在其中50％的孔体积由较小的孔隙贡献和50％的孔体积由较大的孔隙贡献下确定的孔径(尺寸)。跨度90被定义为相对孔径跨度，并且被计算为(pd90-pd10)/pd50，其中pd10是在10％累积孔体积贡献下的孔径，pd50和pd90被定义为在50％和90％累积孔体积贡献下的孔径，分别基于汞数据。

1.键合阳离子表面的聚亚乙基亚胺(pei)

在这些实施例中使用了可得自格雷斯公司(w.r.grace)的六种不同等级的二氧化硅(a、b、c、d、e、f)，并且它们的性质(bet表面积、孔体积、孔径分布跨度90和中值孔径pd50)列于下表i中：

表i

这些二氧化硅的粒度在5微米到70微米范围内。二氧化硅b是商品名为w900的商用二氧化硅，二氧化硅c是商品名为xwp500的商用二氧化硅，二氧化硅f是商品名为的商用二氧化硅。所有这些都可得自格雷斯公司(w.r.grace&co.)。二氧化硅g是可商购的(硅胶上的聚亚乙基亚胺，粉末，40-200目，购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrichcorporation))pei键合的二氧化硅样品。表中的二氧化硅h是硅藻土(粉末，适用于大多数过滤，购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrichcorporation))，并且使用与其它样品相同的程序尝试与peha键合。

二氧化硅a、b具有大于1.0cc/g的孔体积和大于1.0的跨度90值的特性。

在实施例中，使用五亚乙基六胺(peha)，小分子多胺的混合物来表示我们的实施例中的pei。

键合过程由两个步骤组成：1)环氧硅烷(3-缩水甘油氧基丙基-三甲氧基硅烷)的表面键合，然后2)peha与表面环氧基团反应(亲核氨基攻击环氧环，这导致环氧环的开口的胺附接，从而形成β-氨基醇(n.azizi、m.r.saidi，org.lett.，2005，7，3649-3651)。

1a.初始键合程序

通过用环氧硅烷处理裸硅胶颗粒(在120℃烘箱中干燥过夜)来制备改性二氧化硅样品。向1l圆底凹入式烧瓶中装入二氧化硅颗粒(100g)，然后在旋转的同时向烧瓶中逐滴加入10g(二氧化硅的10重量％)的环氧硅烷。使混合物在旋转蒸发仪上翻滚过夜(16h)。分离小部分(2g)样品并用10ml丙酮洗涤5次，然后在70℃烘箱中干燥20小时。通过使用leco仪器对干燥的样品进行碳含量的量的元素分析。

1b.pei反应

从上文1a中获得的样品中称量20g键合的二氧化硅并放入锥形瓶中。在小烧杯中称量6gpeha(二氧化硅的30重量％)，并与100gdiw混合以溶解peha，从而提供约15％的二氧化硅浆料以用于反应。充分摇振混合物并将其静置在水浴中(65℃下持续30分钟)。反应后，用di水进一步稀释二氧化硅，过滤。然后用50ml0.5mhcl浸泡二氧化硅20分钟至30分钟并过滤。所得的二氧化硅用diw洗涤3次(3×100ml)，并在90℃下将少量样品干燥过夜。干燥后的样品进行c％分析。在分析之前，将其余的样品在环境条件下在橱内干燥。

1c.分批结合能力测试

在这些实施例中使用两种模型化合物：1.dna寡核苷酸(来自购自西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)的鲱鱼精子的脱氧核糖核酸)，小于50个碱基对，mw＜15000。2.牛血清白蛋白(bsa)(冻干粉末，结晶型，≥98.0％，购自西格玛公司(sigma))，mw约66000。

测试方法：使用具有20mmtris-hcl缓冲剂的ph8.0的bsa溶液(5mg/ml)或者具有10mm磷酸钠缓冲剂的ph3.45的dna溶液(2mg/ml)进行结合能力测试。将干燥的二氧化硅样品称重到小瓶中，然后蛋白质溶液(使用10sbiouv-vis分光光度计在280nm处测量uv/vis吸附)。2小时后，收集上清液，在相同条件下再次测量吸附。计算uv/vis信号下降的百分比(吸附前后的下降越高，结合能力越大)。对一个样品进行三次平行吸附测量，并计算和报告平均值。

下表示出了实施例1至10的结合能力结果：

表2

如上所述，实施例1至6通过用环氧硅烷处理干燥的二氧化硅，然后使二氧化硅中间体与peha反应来制备。通过从环氧键合的二氧化硅的c％中减去总c％计算得到的c％值表示反应中附接的胺的总量。对于样品7(商用pei-二氧化硅)(在通过将样品放置在空气中的460℃消声炉中过夜来消耗掉样品的表面基团后进行bet和hg测量)，使用相同的测量方法测量dna和bsa的结合。实施例8的硅藻土(二氧化硅h)也使用相同的程序用peha键合。如所示的，实施例8具有非常低水平的键合的peha的量(由于非常低的表面积)和吸附的dna的量。

上述结果表明，为了获得大量的吸附的dna和bsa，需要高的孔体积和跨度90。样品1、2和3的孔体积和跨度90均大于1.0，并且这些样品显示出与dna和bsa两者的较高结合。其它样品都显示出较低的结合。在实施例9中，由于其表面积大，未键合的二氧化硅a具有一定的与dna和bas的结合能力，但与peha键合的样品1相比，该结合非常低。

下图示出了二氧化硅a和二氧化硅g的孔径分布(得自压汞法)的比较。如所述的，二氧化硅a具有最宽的孔径分布，范围从至超过

图

2.使二氧化硅与阴离子聚合物键合以用于结合碱性蛋白质

2a.制备

阴离子聚合物键合的二氧化硅的制备通过以下操作来实现：使聚合物的中性水性溶液(用碱诸如氢氧化铵或氢氧化钠进行中和)与二氧化硅混合，然后在190℃下烘烤5小时以迫使聚合物和表面基团的键合形成。市售的聚(丙烯酸)或聚(甲基丙烯酸)(购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))的溶液通过以下操作制备：在di水中溶解(或稀释，如果市售产品是水性溶液)聚合物，并将溶液的ph用氢氧化铵(或氢氧化钠)调节到7-8。溶液的浓度为约18％。

将20g二氧化硅(二氧化硅a)与含有约10g网状聚合物的聚合物溶液混合。将混合物置于陶瓷容器中并放置在通风良好的通风橱中的烘箱中。将混合物在90℃下加热直至看不到液体，然后在190℃下烘烤5小时。用di水将所得的混合物重新制浆，并用5×200ml的10％nacl和1×200ml的nahco3洗涤，然后用3×100ml的di水。

2b.蛋白质结合评估

程序类似于1c所述的程序，不同之处在于本测试中使用溶菌酶(来自鸡蛋清，冻干粉末，蛋白质≥90％，≥40,000单位/mg蛋白质，购自西格玛(sigma))，并且蛋白质浓度在ph7.0的50mm磷酸钠中为25mg/ml。通过在室温下温育2小时后在280nm波长处的uv/vis信号损失量来测量并通过溶菌酶吸收系数计算吸附的蛋白质的量。

下表3示出了以下实施例11至14的蛋白质结合结果：

表3.

表3表明较高的溶菌酶结合与聚合物的高分子量相关。低分子量聚合物样品具有与对照的无聚合物键合的二氧化硅(样品14)类似的结合。

尽管已经用有限数量的实施方案描述了本发明，但是这些具体实施方案并不旨在限制本文其它地方所述和要求保护的本发明的范围。在阅读了本文的示例性实施方案之后，对本领域的普通技术人员明确的是，进一步的修改、等同形式和变型形式是可能的。除非另外指明，否则实施例以及说明书的其余部分中的所有份数和百分比都以重量计。另外，说明书或权利要求书中所述的任何数值范围，诸如表示性质、测量单位、条件、物理状态或百分比的具体集合的数值范围旨在通过引用或其它方式在本文中明确按字面意义包括落在这类范围内的任何数值，包括在所述任何范围内的任何数值的子集。例如，在公开具有下限rl和上限ru的数值范围的情况下，落入该范围的任何数值r是具体公开的。具体地，该范围内的以下数值r是具体公开的：r＝rl+k(ru-rl)，其中k为具有1％增量的1％至100％范围内的变量，例如k为1％、2％、3％、4％、5％...50％、51％、52％...95％、96％、97％、98％、99％或100％。此外，还具体公开了如上文所计算的由任意两个r值表示的任何数值范围。结合上述说明书和附图，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的任何修改对于本领域技术人员而言将变得明确。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。本文列举的所有出版物通过引用其全文并入本文。