本发明属于生化工程和高分子材料技术领域，具体涉及一种混合型阴离子交换介质及其制备方法。
背景技术：
生物分离介质是目前公认的最有发展前途的一种生分离材料，已广泛用于生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等生物制药行业中，已成为医药生物高技术产业的关键技术。
离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC)是一种高效的分离方法，该法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，它具有较高的分离容量。由于离子交换层析法分辨率高、工作容量大且易于操作，已广泛应用于医药、化工、冶金、食品等领域，也已成为蛋白质、多肽、核酸及核酸分离纯化的重要方法。离子交换介质是有三部分组成：(1)交联的网状骨架，即母体结构；(2)固定在骨架上的功能基团，它是带电基团，标志离子交换层析介质的基本性能；(3)与功能基团带相反电荷、可移动、能进行交换的活动离子(可称为平衡离子)。目前市场上常用的阴离子交换介质主要有常规的阴离子交换介质：带正电荷的化合物二乙基氨基乙基(DEAE)作为配基的DEAE层析介质和带正电荷的化合物季氨盐(Q)作为配基的Q层析介质，如GE的DEAE Sepharose FF和Q Sepharose FF；另外还有混合模式的阴离子交换介质，如Capto adhere；混合模式的层析介质是指在填料骨架上结合了两种或者多种不同分离基质的配基，即结合了不同的离子交换、亲和作用、尺寸排阻和疏水模式。这样能够对这些蛋白质分离的模式进行合并和利用，提高纯化的选择性，来去除杂质，简化工艺。
技术实现要素：
针对上述现有技术中的不足，本发明提供了一种混合型阴离子交换介质及其制备方法。该混合型阴离子交换介质(以下简称Bestarose MIX-A DL)同时具有疏水性相互作用和强阴离子交换模式的特性，可提高对目的蛋白的选择性，简化工艺。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种混合型阴离子交换介质的制备方法，包括如下步骤：
S1、配基苯基缩水甘油醚的合成：用环氧氯丙烷与苯酚进行开环醚化反应，形成苯基缩水甘油醚，利用相转移催化剂聚乙二醇进行催化一步得到苯基缩水甘油醚；
S2、配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的合成：在碱性条件下，用环氧氯丙烷与三甲胺盐酸盐反应得到2,3-环氧丙基三甲基氯化铵即GTA；
S3、配基与琼脂糖交联：先把琼脂糖珠体逐渐用体积分数为20vol％、40vol％、60vol％、80vol％、100vol％的丙酮水溶液置换至丙酮中，将合成好的配基苯基缩水甘油醚交联至琼脂糖表面；然后将合成好的苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵交联，得到所述混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL。
优选的，在步骤S1苯基缩水甘油醚的合成中：将苯酚、环氧氯丙烷、PEG及三氯甲烷混合，加热至35～45℃，反应10h；结束反应后，过滤，用水清洗，在4mmHg下减压蒸馏，收集93～95℃馏分的产物；然后用气相色谱检测产物含量，备用。本技术方案中采用了相转移催化剂PEG，利于醚化反应进行。
进一步的，所述苯酚与环氧氯丙烷的摩尔比为1:2；所述PEG与溶剂三氯甲烷的体积比为1：10。
优选的，在步骤S2配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的合成中：将一定量的环氧氯丙烷放入反应器中，冰却至0～5℃，不断搅拌，加入一定质量的三甲胺盐酸盐，然后常温下反应3～5小时；反应完后，过滤，再用丙酮洗涤3到5次，真空干燥，即得到产物GTA白色固体。
进一步的，所述三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：(4～6)。
进一步的，所述三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：5。
优选的，在步骤S3配基与琼脂糖的交联中，包括：
S31、含有苯基的琼脂糖珠体合成：将苯基缩水甘油醚与琼脂糖珠体交联，取琼脂糖含量为6wt％的交联珠体100ml，装入层析柱中，装入层析柱中，用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的水分，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用100vol％丙酮过柱；将置换好的琼脂糖珠体倒入反应器中，加入5ml的丙酮、0.3ml的BF3乙醚溶液，搅拌均匀；再加入5ml苯基缩水甘油醚为0.4M的丙酮溶液，在20℃下，搅拌1.5h，反应结束；先用丙酮洗涤，然后用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的丙酮，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用水洗涤，即得到含有苯基的琼脂糖珠体；
S32、MIX-A混合模式介质合成：将含有苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)交联，先将含有苯基的琼脂糖珠体100ml，倒入反应器中，加入100ml 50wt％NaOH，充分混合，再加入GTA，不断搅拌，温度50℃下，反应3h后，停止反应，用乙醇，去离子水交替洗涤3次，最后得到产品，将产物在20wt％乙醇保存。
本发明还提供了根据上述所述制备方法制得的混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL。
上述混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL的结构如式(Ⅰ)，
所述表示琼脂糖珠体。
本发明的有益效果在于：
1)、本发明混合型阴离子交换介质是先用环氧氯丙烷苯酚反应得到苯基缩水甘油醚，用环氧氯丙烷与三甲胺盐酸盐反应得到2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，然后在碱性条件下分步将苯基缩水甘油醚和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵交联到琼脂糖表面(如图1所示)。此介质在骨架琼脂糖微球上交联了强阴离子交换基团(季铵盐)和疏水基团(苯基)，因此它同时具有疏水性相互作用和强阴离子交换模式的特性，提高了对目的蛋白的选择性，进而对工艺进行优化。根据该混合型阴离子交换介质的特性，可应用于生物制药中的各个领域，尤其是单抗制备中，对去除宿主DNA、宿主蛋白、聚体和病毒具有显著效果。
2)、本发明的制备方法，在配基苯基缩水甘油醚的合成中利用相转移催化剂聚乙二醇(PEG)进行催化可一步得到缩水甘油醚，并提高收率。
3)、本发明通过苯基缩水甘油醚的环氧基和琼脂糖珠交联的配基具有稳定性好和配基脱落率低的优点，这对介质本身的性质以及产品质量至关重要，有效保证了本发明介质的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
本发明制备过程如图1流程所示。
实施例1
S1、配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)的合成：将78.3ml环氧氯丙烷放入反应器中，冰却至0℃，不断搅拌，加入19.12g三甲胺盐酸盐(分子量为95.6)(三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：5)，然后常温下反应4小时；反应完后，过滤，再用丙酮洗涤3到5次，真空干燥，即得到产物GTA白色固体，收率在97％、纯度为96％；
S2、苯基缩水甘油醚合成：将88ml苯酚、157ml环氧氯丙烷、20ml PEG及2000ml三氯甲烷混合，加热至40℃，反应10h；结束反应后，过滤，用水清洗，在4mmHg下减压蒸馏，收集93～95℃馏分的产物；然后用气相色谱检测产物含量，备用；
S3、含有苯基的琼脂糖珠体合成：将苯基缩水甘油醚与琼脂糖珠体交联，取琼脂糖含量为6wt％的交联珠体100ml，装入层析柱中，用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的水分，逐步调整丙酮的水溶液体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用丙酮过柱；将置换好的琼脂糖珠体倒入反应器中，加入5ml的丙酮、0.3ml的BF3乙醚溶液，搅拌均匀；再加入5ml苯基缩水甘油醚为0.4M的丙酮溶液，在20℃下，搅拌1.5h，反应结束；先用丙酮洗涤，然后用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的丙酮，逐步调整丙酮的水溶液体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用水洗涤，即得到含有苯基的琼脂糖珠体；
S4、MIX-A混合模式介质合成：含有苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)交联，先将含有苯基的琼脂糖珠体100ml，倒入反应器中，加入100ml 50wt％NaOH，充分混合，再加入GTA，不断搅拌，温度50℃下，反应3h后，停止反应，用乙醇、去离子水交替洗涤3次，最后得到产品混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL，将产品置于20wt％的乙醇中保存。
实施例2
S1、配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)的合成：将78.3ml环氧氯丙烷放入反应器中，冰却至0℃，不断搅拌，加入23.9g三甲胺盐酸盐(三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：4)，然后常温下反应4小时；反应完后，过滤，再用丙酮洗涤3到5次，真空干燥，即得到产物GTA白色固体，收率在97％，纯度为96％；
S2、苯基缩水甘油醚合成：将88ml苯酚、157ml环氧氯丙烷、20ml PEG及2000ml三氯甲烷混合，加热至40℃，反应10h；结束反应后，过滤，用水清洗，在4mmHg下减压蒸馏，收集93～95℃馏分的产物；然后用气相色谱检测产物含量，备用；
S3、含有苯基的琼脂糖珠体合成：将苯基缩水甘油醚与琼脂糖珠体交联，取琼脂糖含量为6wt％的交联珠体100ml，装入层析柱中，用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的水分，逐步调整丙酮水溶液体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用丙酮过柱；将置换好的琼脂糖珠体倒入反应器中，加入5ml的丙酮、0.3ml的BF3乙醚溶液，搅拌均匀；再加入5ml苯基缩水甘油醚为0.4M的丙酮溶液，在20℃下，搅拌1.5h，反应结束；先用丙酮洗涤，然后用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的丙酮，逐步调整丙酮的水溶液25vol％、50vol％、75vol％，最后用水洗涤，即得到含有苯基的琼脂糖珠体；
S4、MIX-A混合模式介质合成：含有苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)交联，先将含有苯基的琼脂糖珠体100ml，倒入反应器中，加入100ml 50wt％NaOH，充分混合，再加入GTA，不断搅拌，温度50℃下，反应3h后，停止反应，用乙醇、去离子水交替洗涤3次，最后得到产品混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL，将产品置于20wt％的乙醇中保存。
实施例3
S1、配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)的合成：将78.3ml环氧氯丙烷放入反应器中，冰却至0℃，不断搅拌，加入15.93g三甲胺盐酸盐(三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：6)，然后常温下反应4小时；反应完后，过滤，再用丙酮洗涤3到5次，真空干燥，即得到产物GTA白色固体，收率在97％，纯度为96％；
S2、苯基缩水甘油醚合成：将88ml苯酚、157ml环氧氯丙烷、20ml PEG及2000ml三氯甲烷混合，加热至40℃，反应10h；结束反应后，过滤，用水清洗，在4mmHg下减压蒸馏，收集93～95℃馏分的产物；然后用气相色谱检测产物含量，备用；
S3、含有苯基的琼脂糖珠体合成：将苯基缩水甘油醚与琼脂糖珠体交联，取琼脂糖含量为6wt％的交联珠体100ml，装入层析柱中，装入层析柱中，用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的水分，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用100vol％丙酮过柱；将置换好的琼脂糖珠体倒入反应器中，加入5ml的丙酮、0.3ml的BF3乙醚溶液，搅拌均匀；再加入5ml苯基缩水甘油醚为0.4M的丙酮溶液，在20℃下，搅拌1.5h，反应结束；先用丙酮洗涤，然后用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的丙酮，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用水洗涤，即得到含有苯基的琼脂糖珠体；
S4、MIX-A混合模式介质合成：含有苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)交联，先将含有苯基的琼脂糖珠体100ml，倒入反应器中，加入100ml 50wt％NaOH，充分混合，再加入GTA，不断搅拌，温度50℃下，反应3h后，停止反应，用乙醇、去离子水交替洗涤3次，最后得到产品混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL，将产品置于20wt％的乙醇中保存。
实施例4
S1、配基2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)的合成：将783ml环氧氯丙烷放入反应器中，冰却至0℃，不断搅拌，加入191.2g三甲胺盐酸盐(三甲胺盐酸盐与环氧氯丙烷的摩尔比为1：5)，然后常温下反应4小时；反应完后，过滤，再用丙酮洗涤3到5次，真空干燥，即得到产物GTA白色固体，收率在97％，纯度为96％；
S2、苯基缩水甘油醚合成：将880ml苯酚、1570mol环氧氯丙烷、200ml PEG及20L三氯甲烷混合，加热至35℃，反应10h；结束反应后，过滤，用水清洗，在4mmHg下减压蒸馏，收集93～95℃馏分的产物；然后用气相色谱检测产物含量，备用；
S3、含有苯基的琼脂糖珠体合成：将苯基缩水甘油醚与琼脂糖珠体交联，用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的水分，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用100vol％丙酮过柱；将置换好的琼脂糖珠体倒入反应器中，加入5ml的丙酮、0.3ml的BF3乙醚溶液，搅拌均匀；再加入5ml苯基缩水甘油醚为0.4M的丙酮溶液，在20℃下，搅拌1.5h，反应结束；先用丙酮洗涤，然后用不同比例的丙酮水溶液置换珠体中的丙酮，逐步调整丙酮水溶液的体积分数为25vol％、50vol％、75vol％，最后用水洗涤，即得到含有苯基的琼脂糖珠体；
S4、MIX-A混合模式介质合成：含有苯基的琼脂糖珠体与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)交联，先将含有苯基的琼脂糖珠体1000ml，倒入反应器中，加入1000ml 50wt％NaOH，充分混合，再加入GTA，不断搅拌，温度50℃下，反应3h后，停止反应，用乙醇，去离子水交替洗涤3次，最后得到产品混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL，将产品置于20wt％的乙醇中保存。
本发明上述实施例中环氧氯丙烷的密度为1.1812g/mL。
上述实施例制备所得到的混合型阴离子交换介质Bestarose MIX-A DL的结构如式(Ⅰ)，
所述表示琼脂糖珠体。
上述实施例中Bestarose MIX-A DL对不同蛋白的吸附效果
针对上述实施例制备所得的Bestarose MIX-A DL产品，利用Bestarose MIX-A DL对牛血清白蛋白(BSA)、重组人血清白蛋白(r-HSA)和单克隆抗体(人源IgG)的10％动态载量，来表征Bestarose MIX-A DL对不同蛋白的吸附效果。
表1.实施例1中Bestarose MIX-A DL和Q Bestarose FF对不同蛋白的10％动态载量
在无氯化钠(NaCl)的条件下，10％的动态载量，表征了介质对蛋白的吸附能力。在相同的结合条件下(无NaCl)，Q Bestarose FF和Bestarose MIX-A DL的10％动态载量几乎无差别，BSA、r-HSA、人源IgG的10％的动态载量都大于50mg/ml。
在存在0.1M NaCl的盐浓度条件下，对于BSA 10％的动态载量，Q Bestarose FF为23mg/ml，下降了59％以上，而Bestarose MIX-A DL为47mg/ml，是Q Bestarose FF载量的2倍以上，与无NaCl相比下降不到10％；在存在0.1M NaCl的盐浓度条件下；对于r-HSA 10％的动态载量，Q Bestarose FF为19mg/ml，下降了60％以上，而Bestarose MIX-A DL为46mg/ml，是Q Bestarose FF载量的2倍以上，与无NaCl相比下降不到10％；在存在0.1M NaCl的盐浓度条件下，对于，Q Bestarose FF几乎对人源IgG不结合，而Bestarose MIX-A DL对人源IgG 10％的动态载量几乎不变。结果表明：Bestarose MIX-A DL对蛋白吸附的结合条件，可以耐受一定浓度的盐浓度，特别是对于人源IgG，使得Bestarose MIX-A DL在抗体药物中得到广泛的应用。
表2.实施例2中Bestarose MIX-A DL和Q Bestarose FF对不同蛋白的10％动态载量
表3.实施例3中Bestarose MIX-A DL和Q Bestarose FF对不同蛋白的10％动态载量
表4.实施例4中Bestarose MIX-A DL和Q Bestarose FF对不同蛋白的10％动态载量
结合表2到表4，结果同样表明：Bestarose MIX-A DL对蛋白吸附的结合条件，可以耐受一定浓度的盐浓度，特别是对于人源IgG，使得Bestarose MIX-A DL在抗体药物中能够得到广泛的应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。