一种植物精油壳聚糖纳米微胶囊及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种植物精油壳聚糖纳米微胶囊及其制备方法和应用，属于生物材料与食品添加剂领域。

背景技术

植物精油又称挥发油或香精油，是植物中萃取得到的具有特有芳香气味的油状液体，可来自于草本植物的花、苞、叶、枝、根、树皮、果实、种子和树脂等。一般通过可以通过水蒸气蒸馏、有机试剂提取、真空分馏以及超临界萃取等方法获得。植物精油的成分组成十分复杂，通常有几十至上百种化合物。植物精油的化学成分一般分为4种：萜类化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含氮含硫化合物。研究表明，研究表明，植物精油不仅能够赋予食品特殊香气，还有着色、抗氧化、抑菌防腐等多方面的生物活性，在食品保鲜、果蔬保藏、杀菌以及驱虫等领域有很大的应用前景。

但是，植物精油气味强烈、挥发性强且溶解性差，易受到光、热等环境因素影响，使用和储存困难，使其的应用受到了很大限制。

壳聚糖是世界上仅次于纤维素含量第二丰富的生物高分子，其可通过几丁质脱乙酰获得。壳聚糖具有优异的生物相容性、可降解性以及黏膜黏附性。特别的，其对革兰氏阴性菌和阳性菌均表现出抗菌作用。这些优异的性能使壳聚糖被广泛的以溶液、凝胶球以及微纳颗粒等形式应用于食品、化妆品、生物药品、农业和化学领域。壳聚糖的微纳颗系统更是被广泛应用于基因、要我、蛋白质、疫苗和酶制剂的递送。使用壳聚糖微胶囊包裹精油也有一些报道。壳聚糖纳米微胶囊可以通过原位聚合、界面聚合、乳化-离子凝胶化以及乳化-溶剂蒸发技术等多种手段合成。在于乳化-离子凝胶化法中，当芯材为油相物质如精油时，向壁材中加入芯材的同时加入乳化剂充分乳化，而后再加入交联剂，能够改善纳米微胶囊的粒径分布和芯材包封率。

生物表面活性剂是由多种微生物产生的两亲性化合物，已被应用于食品，化妆品，制药，石化，环保等多个领域。甘露糖赤藓糖醇脂(mel)是含亲水部分4-o-β-d-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇和疏水部分脂肪酸和乙酰基的糖脂生物表面活性剂。甘露糖赤藓糖醇酯分为具有不同乙酰基和脂肪酸的四种化学结构，即a，b，c和d型。甘露糖赤藓糖醇脂拥有优异的乳化性，能显著降低表面和界面张力。其临界胶束浓度极低，mel-a和mel-b的临界胶束浓度分别为4.0×10^-6和6×10^-6m。有趣的是，甘露糖赤藓糖醇脂还能够诱导人类早幼粒细胞白血病细胞系和大鼠嗜铬细胞瘤的细胞凋亡和细胞分化。另外，甘露糖赤藓糖醇脂具抗菌作用。mel-a和mel-b对诸如枯草芽孢杆菌，藤黄微球菌，紫红分枝杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌以及核黄素假单胞菌等革兰氏阴性菌有较强的抑制作用。

离子液体是一种室温熔融盐，其被认为是一种绿色的溶剂而被广泛的用于替代有机溶剂等对环境危害较大的溶剂。已有较多文献报道了利用离子液体溶解壳聚糖、几丁质、纤维素等生物高分子物质。

目前，关于提高植物精油的稳定性、延长其功效和扩展其用途的研究还相对应缺乏，使得植物精油利用效益不高，无法完全体现出植物精油的经济价值。另外，尚未有研究报道了使用离子液体替代醋酸溶液进行纳米微胶囊的制备。

技术实现要素：

本发明提供了一种植物精油壳聚糖纳米微胶囊，能提高精油的稳定性、延长其功效和扩展其用途。

一种植物精油壳聚糖纳米微胶囊，包括壁材和芯材，所述壁材由壳聚糖和交联剂在醋酸水溶液或离子液体水溶液中交联形成，所述芯材为植物精油和甘露糖赤藓糖醇脂；

其中，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐或1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐；所述植物精油为香榧假种皮精油、柑橘精油、丁香精油、肉桂精油中的至少一种。

通过纳米微胶囊技术包载植物精油，一方面可以降低植物精油的挥发性，提高精油的光热稳定性，延长其功效作用时间；另一方面，在不破坏精油的同时，将液态的精油以固态形式存储，极大扩展了其用途。

特别地，本发明使用离子液体替代醋酸水溶液制备壳聚糖纳米微胶囊。离子液体是一种绿色溶剂，其具有无毒、不易挥发、可重复利用等优良特性。使用醋酸溶解壳聚糖制备纳米微胶囊的过程中，醋酸会对植物精油中的活性成分造成破坏，醋酸的残留也会对后续冻干等步骤以及纳米微胶囊的应用造成影响。使用离子液体溶解壳聚糖可以很好地避免上述问题，且最后得到的包封率和醋酸水溶液无显著差异，分别为99.86％和99.79％。

甘露糖赤藓糖醇脂(mel-a)是一种天然生物表面活性剂，既有优良的表面性能，又易于在环境中被生物降解。特别的，甘露糖赤藓糖醇脂对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较强的抑制作用。在纳米微胶囊制备中，使用甘露糖赤藓糖醇脂能够使植物精油在壳聚糖溶液中获得较好的乳化状态，使植物精油均匀分布在乳液中，因此能够获得粒径较为均匀的壳聚糖纳米微胶囊，也能提高植物精油的包封率。

作为优选，所述壳聚糖的分子量可以为50000-200000道尔顿，在一些实施方案中壳聚糖分子量为200000道尔顿。

作为优选，所述壳聚糖纯度在98％以上。

作为优选，所述交联剂可以为三聚磷酸钠。优选的，所述三聚磷酸钠和壳聚糖的质量比可以为1∶10-1∶2。

所述离子液体可为1-丁基-3-甲基咪唑([bmim]cl)、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐([bmim]ac)、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([emim]ac)和1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐([acmim]cl)，考虑到壳聚糖的溶解性能，作为优选，可为[acmim]cl。使用离子液体代替醋酸溶解壳聚糖，可有效避免醋酸对植物精油活性成分的破坏。

作为优选，所述植物精油可为香榧假种皮精油、柑橘精油、丁香精油、肉桂精油中的至少一种。更优选，考虑新颖性，可为香榧假种皮精油。

作为优选，所述植物精油和壳聚糖的体积质量比为1μl∶10mg-5μl∶4mg。得到的纳米微胶囊粒径较小，包封率较高。

作为优选，所述甘露糖赤藓糖醇脂的分子量为550-690道尔顿。

作为优选，所述甘露糖赤藓糖醇脂的纯度在95％以上。

所述甘露糖赤藓糖醇脂可以为ustligomaydis属和pseudazyma属菌种发酵得到的发酵液中分离纯化得到的。

本发明还提供了上述植物精油壳聚糖纳米微胶囊的制备方法，包括：

(1)将壳聚糖溶解于醋酸水溶液或离子液体水溶液，搅拌均匀，得到壳聚糖溶液；

(2)向壳聚糖溶液中依次加入甘露糖赤藓糖醇脂、植物精油，使用磁力搅拌搅拌均匀后，在10000-15000rpm条件下均质5-10min获得均匀乳液；

(3)在800-2500rpm的磁力搅拌下，使用恒流泵在2-20rpm的流速下加入交联剂；充分搅拌完成反应后，高速离心，洗涤，冷冻干燥后得到植物精油壳聚糖纳米微胶囊；

其中，所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐或1-羧甲基-3-甲基咪唑氯盐；所述植物精油为香榧假种皮精油、柑橘精油、丁香精油、肉桂精油中的至少一种。

作为优选，步骤(1)中所述壳聚糖溶液的浓度可为0.02％-0.2％，更优选为0.1％。

作为优选，步骤(2)中所述植物精油的添加量可为3-25μl/20ml壳聚糖溶液；更优选，可为3μl/20ml壳聚糖溶液，此时，得到的粒径较小，醋酸水溶液中为349.6±10.6nm，包封率可达到99.86％(醋酸溶液中)和99.79％(离子液体中)。

具体地，所述制备方法可以为：

(1)称取一定质量的壳聚糖，溶解于1％的醋酸水溶液中或2％的[acmim]cl水溶液中，充分混合均匀，磁力搅拌过夜，得到0.1％的壳聚糖溶液；制备浓度为0.025％-0.125％的三聚磷酸钠水溶液，备用；

(2)向20ml壳聚糖溶液中加入1mg甘露糖赤藓糖醇脂，800-2500rpm磁力搅拌半小时获得均匀的乳液；再向其中加入植物精油，并在10000-15000rpm条件下均质5-10min，使精油形成均匀乳液；

(3)在800-2500rpm的磁力搅拌下，使用恒流泵向20ml上述均匀乳液中，逐滴加入三聚磷酸钠水溶液6-20ml；

(4)充分搅拌完成反应后，高速离心，洗涤，冷冻干燥后得植物精油壳聚糖纳米微胶囊。

作为优选，所述三聚磷酸钠水溶液的浓度为0.075％。

作为优选，所述三聚磷酸钠水溶液的添加量为10ml。所述三聚磷酸钠水溶液使用恒流泵加入乳液中，乳液始终处于磁力搅拌条件下；搅拌速度优选为1800rpm。作为优选，恒流泵加入速度可为2-20rpm，更优选为13rpm。

本发明还提供了上述植物精油壳聚糖纳米微胶囊在包埋植物精油中的应用。试验表明，该植物精油壳聚糖纳米微胶囊对植物精油包裹较好，应用范围广。

本发明制备了一种植物精油壳聚糖纳米微胶囊，用于包埋植物精油，在不破坏精油的同时，将液态的精油以固态形式存储；降低了精油的挥发性，提高了精油的光热稳定性，延长了精油的功效作用时间，克服了精油气味刺激、难以储存、稳定性差和使用范围窄的问题；制备过程安全、无毒、绿色，极大扩展了植物精油的应用范围。特别的，对香榧假种皮精油的利用，提高了香榧假种皮的经济价值，为香榧假种皮的废物处理和深度加工提供了技术支持。

附图说明

图1为甘露糖赤藓糖醇脂结构图；a型：r1＝r2＝ac；b型：r1＝ac，r2＝h；c型：r1＝h，r2＝ac；d型：r1＝r2＝h，n＝6-16。

图2(a)不同三聚磷酸钠浓度下为纳米微胶囊的粒径；(b)为不同三聚磷酸钠加入速度为纳米微胶囊的粒径；(c)为加入不同浓度香榧假种皮精油的纳米微胶囊的粒径和zeta电位，*代表了样品发生了沉降。不同上标表示不同处理间的显着差异(p＜0.05)。

图3(a)为粒径分布图；(b)为透射电镜图(图中的标尺为200nm)；(c)为傅里叶变换红外光谱图；(d)为x射线衍射图；(e)为抑菌圈大小图。(cs，cs-nano，cs-nano-mel-teos，il-cs-nano和il-cs-nano-mel-teos分别为壳聚糖，醋酸中制备的空纳米微胶囊，醋酸中制备的含有甘露糖赤藓糖醇脂和植物精油的纳米微胶囊，离子液体中制备的空纳米微胶囊以及离子液体中制备的含有甘露糖赤藓糖醇脂和植物精油的纳米微胶囊，下同)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，实验试剂来源：

壳聚糖来自酷尔化学科技(北京)有限公司。香榧假种皮精油购自上海木照香堂公司。离子液体[acmim]cl购自上海爱纯生物科技有限公司。三聚磷酸钠(分析纯)购自上海麦克林生化科技有限公司。冰醋酸(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1纳米微胶囊的制备

一、纳米微胶囊材料的准备

1、甘露糖赤藓糖醇脂的生产与纯化

甘露糖赤藓糖醇脂由蚜虫拟酵母(pseudozymaaphidis)dsm70725(购于德国微生物及细胞保藏中心)产生。a型甘露糖赤藓糖醇脂(mel-a)的生产和纯化方法：首先将蚜虫拟酵母接种到含有3％酵母提取物，3％麦芽提取物，10％葡萄糖和5％蛋白胨的活化培养基中，并在28℃和180rpm下培养36小时。活化后，将1ml菌液培养物接种到由nano33g/l，mgso4·7h2o0.3g/l，kh2po40.3g/l，酵母提取物1g/l，葡萄糖40g/l和蒸馏水组成的种子培养基。在28℃和180rpm培养2天后，将种子培养物离心并用生理盐水洗涤两次。将得到的细胞接种于含80ml/l大豆油，mgso4·7h2o0.3g/l，kh2po40.3g/l，nano33g/l，酵母提取物1g/l的发酵培养基中。发酵过程在28℃，180rpm下进行7天。发酵结束后，加入相同体积的乙酸乙酯并充分震荡萃取甘露糖赤藓糖醇脂。

将混合物以3,800rpm离心15分钟，分离有机层并减压蒸发。用甲醇∶环己烷(1∶1，v/v)萃取两次以除去剩余的油和脂肪酸后，用硅胶柱从粗制mel中纯化mel-a，并通过薄层色谱(硅胶gf254，三氯甲烷∶甲醇∶水＝65∶15∶2，v/v)检验产物。

2、香榧假种皮精油的成分分析

使用气相色谱质谱联用(7890b/7000c，141agilenttechnologies，paloalto，usa)的方法确定香榧假种皮精油的成分。色谱柱为石英毛细管柱hp-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)。进样口温度为250℃，进样量1μl，载气为高纯he气，流速为1ml/min，分流比15∶1。程序升温：初始温度50℃，保持2min，以5℃/min升至150℃，保持1min，再以8℃/min升温至280℃，保持2min。质谱条件：接口温度280℃，电子轰击(ei)源，电子能量70ev，扫描质量范围30.00～550.00amu。

表一香榧假种皮精油主要成分

3、纳米微胶囊的制备

空纳米微胶囊以离子交联方法制备：将壳聚糖溶解于1％(v/v)的醋酸溶液或2％(w/v)的[acmim]cl水溶液当中，磁力搅拌过夜，获得均一的、浓度为0.1％(w/v)的壳聚糖溶液。在磁力搅拌条件下，向20ml壳聚糖溶液中加入10ml不同浓度的(0.025，0.05，0.075，0.1and0.125％)三聚磷酸钠水溶液。通过恒流泵探索不同加入速度(2，5，7，10，15和18rpm)对纳米微胶囊形成的影响。

含有植物精油的纳米微胶囊的制备：向20ml壳聚糖溶液中加入甘露糖赤藓糖醇脂，磁力搅拌半小时，加入3-25μl香榧假种皮精油，均质5分钟(ultra-turraxt18，ika)获得均匀的乳液。在磁力搅拌条件下，用恒流泵向20ml乳液中加入10ml三聚磷酸钠水溶液；充分搅拌完成反应后，高速离心，洗涤，冷冻干燥后得香榧假种皮精油壳聚糖纳米微胶囊。

实施例2纳米微胶囊的表征

一、纳米微胶囊的理化性质表征

粒径分布和zeta电位：

通过动态光散射(dls)在633nm波长处适应zetasizernanozs90(malverninstrumentsltd，malvern，英国)测定纳米微胶囊的粒径分布、分散指数和zeta电位。温度设定为25℃，测定角度为90°。

从图2a中我们可以看到，当三聚磷酸钠浓度低于0.075％时，空纳米微胶囊的粒径随着三聚磷酸钠浓度的提高而减小，在0.075％时最小为157.4±2.2nm。当三聚磷酸钠的浓度进一步增大，样品开始变得不稳定并迅速发生沉降。

将三聚磷酸钠的浓度确定为0.075％，进一步探究加入速度对纳米微胶囊粒径的影响。测定了2、5、7、10、13、15以及18rpm的加入速度得到的粒径。从图2b中可以看到，13和15rpm之间没有显著差异，得到的粒径最小。

精油添加量对纳米微胶囊的粒径也有十分明显的影响。图2c展示了不同精油添加量对粒径和zeta电位的影响。结果表明，精油的添加量对zeta电位基本没有影响，而对粒径有较大影响。精油添加量越大，粒径越大。

最终确定的优选条件为：三聚磷酸钠浓度0.075％，加入速度13rpm，精油添加量为1μl/20ml壳聚糖溶液。以此条件，制备cs-nano，cs-nano-mel-teos，il-cs-nano和il-cs-nano-mel-teos。

包封率测定：

高速离心，洗涤，冷冻干燥后得到香榧假种皮精油壳聚糖纳米微胶囊。上清液用于测定香榧假种皮精油的包封率。未包封的精油浓度使用气相色谱质谱联用方法测定。通过比较上清液和梯度浓度精油中的3-蒈烯含量，计算得到上清液中精油浓度，并通过下面的公式计算包封率：

包封率(％)＝(加入总的精油浓度-为包封精油浓度)/加入总的精油浓度

表2香榧假种皮精油纳米微胶囊平均粒径、多分散系数和zeta电位

不同上标字母表示不同处理间差异显着(p＜0.05)。

形态观察：

用jem-1230透射电子显微镜(jeol，日本)观察纳米微胶囊的形态。将具有薄膜的铜网浸入样品溶液中，然后用醋酸双氧铀染色。使用薄纸小心地吸干多余的液体，而不接触铜网。然后在120kv的加速电压下分析样品。

x射线衍射和傅里叶变换红外光谱：

纳米微胶囊的物理性质由x射线衍射和傅里叶变换红外光谱进行分析。x射线衍射的数据由一台x射线衍射仪(d8a25advanced，bruker，德国)获取。所有样品从5°扫到90°。

傅里叶变换红外光谱的数据在400-4000cm^-1波数范围内获取，样品使用溴化钾小片法制备。设备为nicoletavatar370(美国)傅里叶变换光谱仪。

图3c和图3d展示了四种样品的傅里叶变换红外光谱和x射线衍射谱，纳米微胶囊组和香榧假种皮精油纳米微胶囊组的特征峰变化均表明了纳米微胶囊的形成以及精油的成功包封。

二、抗菌效果评估

使用牛津杯法测定香榧假种皮精油壳聚糖纳米微胶囊针对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌圈。首先，在lb平板上涂布100μl菌落总数约为10⁷cfu/ml的菌液。37℃培养箱培养30min后，向平板上插入牛津杯，每一个牛津杯中加入150μl的纳米微胶囊溶液。醋酸溶液被用作对照。在37℃培养24h后，测量抑菌圈直径。

图3e的抑菌圈统计结果表明，离子液体中制备的香榧假种皮壳聚糖纳米微胶囊的抑菌能力显著高于不含精油的壳聚糖纳米微胶囊。表明了精油的成功包封。