专利名称：Exendin-4偶联超顺磁性氧化铁纳米颗粒制法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物和医药技术领域，涉及材料化学，具体为通过合成聚乙二醇修饰的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Polyethylene glycol Coated Superparamagnetic Iron Oxide PEG-SPIO)，并将exendin-4偶联其上，制备出具有beta细胞靶向性的超顺磁性氧化铁纳米颗粒SPIO-exendiM，应用该造影剂实现胰高血糖素样肽-I(GLP-I)受体高表达的胰岛素瘤的靶向显像。本发明还涉及该材料对beta细胞的体外标记应用。
背景技术：
胰岛素瘤是来源于beta细胞的内分泌肿瘤，尽管其发病率较低(1 4/106)，但却是最常见的胰腺内分泌肿瘤。胰岛素瘤多呈散发的，局限于胰腺内的实性、良性小肿瘤(直径多小于2. 0cm)。手术是胰岛素瘤标准治疗方式，可达到75 98%的治愈率，而对胰岛素瘤的定位(包括原发灶及转移灶)则是准确手术切除的先决条件。对胰岛素瘤常用的临床术前定位通常采用B超，CT,MRI等，增强CT扫描诊断敏感性可达到57 94%，增强MRI则有30 98%的敏感性。但对于Icm以内的胰岛素瘤，两者的敏感性则大大降低，对于散在、 多发的微小病灶的定位则更加困难；而且，有10 27%为隐匿性胰岛素瘤。而发展一类可靶向显像胰岛素瘤的特异探针则对微小及隐匿胰岛素瘤的定位具有现实意义。GLP-I受体在90%以上的胰岛素瘤上均有较高水平的表达(为生长抑素受体2 表达水平的2倍)，而在胰腺外分泌腺表达较低，这为实现胰岛素瘤(区别于胰腺外分泌腺的)显像提供了良好的靶点。目前，国际上已采用标记的eXendin-4(GLP-l类似物) 欲实现人胰岛素瘤的SPECT成像；也有研究者采用68Ga标记exendin-3 (另一种GLP-I的类似物)，在小鼠胰岛素瘤模型上应用PET进行肿瘤显像。SPECT及PET尽管敏感性高，但空间分辨率低，同时，放射性核素对受试者也存在一定影响。磁共振(MRI)拥有优秀的空间分辨率，且无创，不涉及核素显像，因而应用MRI实现胰岛素瘤的特异显像具有更好的前景。既往国际文献报导的采用核素(如111In)标记exendin-4实现胰岛素瘤的靶向显像，但核素显像存在空间分辨率低及造影剂体内代谢快、半衰期短等缺陷。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种GLP-I类似物exendin-4偶联的，可靶向 GLP-I受体的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO-exendiM)的制备方法，采用该方法制备的 SPI0-exendin4能用于胰岛素瘤的靶向显像，并可提高SPIO对beta细胞的标记效率。为了解决上述技术问题，本发明提供一种SPIO-exendiM的制备方法，采用高温水解金属醇盐螯合物过程制备出超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIO)，采用双羧基聚乙二醇对所述颗粒进行表面修饰，制备出PEG-SPI0，在此基础上，将GLP-I类似物exendin-4偶联于 PEG-SPIO制得本产品。本发明是采用高温水解金属醇盐螯合物过程制备出SPIO纳米颗粒，应用APS对 SPIO进行硅烷化修饰及PEG对APS-SPIO颗粒进行表面包被，得到PEG-SPI0，进一步采用NHS/EDC方法将exendin-4偶联于PEG-SPIO上，从而得到具有beta细胞靶向性的纳米材料 SPI0-exendin4o本发明的具体步骤如下1)、在惰性气体的保护下，于室温中将!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黄褐色溶液；FeCl3*6H20 与 FeCl2*4H20 的摩尔比为 2 1，FeCl3 ·6Η20 在黄褐色溶液中的浓度为0. 01 0. IM ；2)、在惰性气体的保护下，将步骤1)所得的黄褐色溶液升温至120 140°C，然后加入去离子水和 2，2' _(乙烯二氧)双(乙胺)(2，2-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) EDEA)，在120 140°C保温30 60分钟，得黑色悬浮液；去离子水与FeCl3 ·6Η20的摩尔比为30 10 1,2,2' _(乙烯二氧)双(乙胺)与FeCl3 ·6Η20的摩尔比为200 400 1 ；3)、将步骤2)所得的黑色悬浮液冷却至室温，加入甲苯离心，去除上清液，得到棕色的氧化铁纳米颗粒(SPI0，为粉末状固体)；甲苯与黑色悬浮液的体积比为1 3 1 ；4)、在惰性气体保护下，将步骤3)所得的氧化铁纳米颗粒分散于甲苯中，使氧化铁纳米颗粒的浓度为0. 005 0. 05Μ ；然后在搅拌的情况下，加入3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺((3-aminopropyl)trimethoxysilane APS)和钛酸丁酯，加热至 70 90°C，回流反应10 16小时；3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APS)与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为5 30 1，钛酸丁酯与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为1 5 1 ；5)、将步骤4)反应结束所得的溶液冷却至室温并离心分离，用甲苯清洗(3 5 次，目的是去除残余未反应的3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APS)或者钛酸丁酯)，得到 APS-SPIO (APS修饰的SPI0，为棕色粉末)；将APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的浓度为0. 005 0. 05M ；然后于室温中在超声及机械搅拌下，加入双羧基PEG(poly(ethylene glycol)bis (carboxymethyl) ether，MW 600)和二环己基碳二亚胺(N，N-dicyclohexyl carbodiimide，DCC)，反应 3 5小时后，所述双羧基PEG与APS-SPIO的摩尔比为1 5 1，二环己基碳二亚胺(DCC)与 APS-SPIO的摩尔比为5 20 1;上述反应结束后，再加入2，2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(EDEA)，于室温中在超声及机械搅拌的条件下继续反应3 5小时；所述2，2'-(乙烯二氧)双(乙胺)(EDEA)与 APS-SPIO的摩尔比为1 5 1;6)、将步骤5)所得的产物离心，用乙醇和去离子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸盐缓冲溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS缓冲溶液)，得到PEG-SPI0的PBS溶液；PEG-SPIO的PBS溶液中！^e元素浓度为3 7毫克/毫升(S卩，以SPIO中的!^e元素为标准测定浓度)；7)、将摩尔比1 2.5的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (N-ethyl-N-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide，EDC)与 N-羟基琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysuccinimide, NHS)混合，得混合物；取步骤6)所得的(部分的)PEG-SPI0的PBS溶液加入exendin-4水溶液和上述混合物，于常温下搅拌反应8 12小时，从而使exendin-4通过表面的羧基与PEG-SPIO表面的氨基通过缩水反应连结到PEG-SPIO表面；通过超滤，将可能残存的EDC与NHS及反应副产物去除，最终得到的SPI0-exendin4 ；exendin-4与！^元素的质量比为0. 5 1. 5 1，PEG-SPIO与EDC的摩尔比为1 2 4。作为本发明的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法的改进步骤2)在搅拌条件下进行。作为本发明的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法的改进惰性气体为Ar。本发明还同时公开了如上述方法制备的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的用途用于胰岛beta细胞的标记及胰岛素瘤的靶向显像。综上所述，本发明采用3_(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺(APQ对制备的SPIO进行硅烷化修饰及双羧基聚乙二醇(PEG)对APS-SPIO颗粒进行表面包被，得到粒径均勻，分散性好，具有较好磁性的纳米颗粒PEG-SPI0。进一步采用NHS/EDC方法将GLP-I类似物 exendin-4 偶联于 PEG-SPI0 上，得到 SPI0_exendin4。该SPIO-exendiM纳米颗粒在体外系列标记实验中(活细胞及固定细胞的标记， 胰腺内原位胰岛的标记及胰岛细胞移植物的标记等)表现出对beta细胞的较高特异性。通过建立胰岛素瘤模型，尾静脉注射SPIO-exendiM，MRI扫描瘤体，可实现对胰岛素瘤的靶向显像。采用本发明制得的SPIO-exendiM的表征(图1 图4)。TEM扫描提示颗粒核心直径约为5 lOnm，尺寸分布集中，在水溶液中分散性良好。纳米激光粒度仪分析结果提示粒径尺寸，包括SPIO核心和外部的修饰层，其平均尺寸为25nm。颗粒表面裹有约20nm左右厚的PEG修饰层，所产生的空间位阻作用平衡了作用在颗粒表面的磁性和范德华吸引力，这为PVP-SPIO纳米颗粒提供了良好的胶体稳定性和生物相容性。为了进一步证实修饰剂被成功包覆在纳米颗粒的表面，我们利用FIlR对SPIO纳米颗粒的表面修饰基团进行表征。从图中可以明显看到PEG和APS的特征吸收峰。图4是 PEG-SPIO在室温(300K)下，外磁场为I时的磁滞回线。从图中可以看出PEG-SPIO纳米颗粒样品表现出超顺磁性，没有余磁和矫顽力，在包覆修饰层后仍具有较高的饱和磁化强度， 达到 27emu/g。通过SPIO-exendiM纳米颗粒在体外的系列标记实验，证明其对高表达GLP-I 受体的beta细胞具有较高的特异性。将100ug/ml铁浓度的非靶向PEG-SPIO及靶向 SPI0-exendin4对INS-I细胞孵育12h后行普鲁士蓝染色，发现SPI0_exendin4比PEG-SPI0 可更多的标记beta细胞。将200ug/ml铁浓度的SPI0_exendin4及PEG-SPIO同4%多聚甲醛固定后的INS-I细胞孵育l，2，4h后行普鲁士蓝染色，结果发现非靶向的PEG-SPIO不能够标记beta细胞，而SPIO-exendiM可有效标记INS-I细胞，且标记细胞数量随着标记时间的延长而增多。通过将200ug/ml铁浓度的PEG-SPIO与SPIO-exendiM同移植入肾包膜下的beta细胞切片孵育池后，普鲁士蓝染色结果提示SPIO-exendiM可有效标记beta细胞移植物。将200ug/ml铁浓度的PEG-SPIO与SPIO-exendiM同胰腺切片孵育池后，普鲁士蓝染色结果提示SPIO-exendiM可有效标记原位胰岛，而对外分泌腺则不能标记。通过建立胰岛素瘤荷瘤裸鼠模型，尾静脉PEG-SPIO及SPIO-exendiM CBmg Fe/kg)，注射后Mh， 给予MRI扫描，T2加权像(T2-weighted image)上，SPI0_exendin4注射组老鼠肿瘤呈现明显的负性增强，普鲁士蓝染色显示在SPIO-exendiM注射组肿瘤内有狗颗粒的沉积，表明胰岛素瘤可被SPI0-exendin4靶向显像。
目前尚没有文献及研究报道将exendin-4偶联于SPIO上合成靶向造影剂。SPIO 为一种新型的MRI造影剂，在其基础上可以偶联不同的物质，如抗体、小分子或肽段等，以形成具有不同用途，不同靶向性的造影剂；且MRI成像相比于核素显像具有较高空间分辨率等优势。SPIO-exendiM合成的第一步是合成PEG-SPI0，然后在PEG-SPIO的基础上，进一步将exendin-4偶联其上，制得具有靶向GLP-1受体的SPI0_exendin4。该SPI0_exendin4用于胰岛素瘤靶向显像的效果在体外实验中，SPI0_exendin4 相比于非靶向的PEG-SPI0，其对胰岛素瘤细胞系具有更高的标记效率，说明SPIO-exendiM 可通过配受体结合而更多的进入细胞内。SPIO-exendiM还可在胰腺切片上区别显示胰岛细胞团。在体内实验中，SPI0-exendin4可靶向聚集于胰岛素瘤内，而使胰岛素瘤在MRI上得到显示，而非靶向的PEG-SPIO则不能显示胰岛素瘤。本发明具有以下特点1、合成的SPIO-exendiM具有良好的理化性质及磁学特性；2、对比于非靶向的PEG-SPI0，靶向的SPI0-exendin4对活细胞及固定的beta细胞均具有较好的标记效率；3、制备的SPIO-exendiM可有效标记beta细胞移植物及胰腺内原位胰岛，且拥有较高的特异性；4、SPI0-exendin4在体内对胰岛素瘤具有良好的靶向显像效果。综上所述，本发明的SPIO-exendiM纳米颗粒用于MRI上胰岛素瘤的靶向显像，为临床上GLP-I受体高表达的胰岛素瘤的靶向、特异诊断(包括原发灶及转移灶)提供有效手段。同时，SPIO-exendiM对beta细胞具有较高的细胞标记效率，为更好的实现胰岛beta 细胞标记及MRI示踪提供了良好的材料。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1PEG-SPI0纳米颗粒的透射电镜照片。图2PEG-SPI0纳米颗粒的纳米激光粒度分析图谱。图3PEG-SPI0纳米颗粒的傅立叶红外吸收光谱。图4PEG-SPI0纳米颗粒的振动样品磁强计室温磁性图谱。图5是Exendin-4结构及SPI0_exendin4的合成策略图；A，Exendin-4分子结构； B, Exendin-4的分子式；C，采用NHS/EDC方法合成SPI0_exendin4的策略。图6-1是100ug/ml铁浓度的PEG-SPI0与PEG-SPI0_Exendin4标记同等数量的 iNs-i细胞Ia1后普鲁士蓝染色图；左图为100ug/ml铁浓度的PEG-SPI0标记INS-1细胞12h后普鲁士蓝染色图；中图为100ug/ml铁浓度的SPI0_exendin4标记INS-1细胞12h后普鲁士蓝染色图；右图为中图的放大，清晰显示细胞被SPIO-exendiM标记； 结果提示相对于普通PEG-SPI0，含靶向的造影剂可更多的标记细胞。
图6-2是INS-I及原代胰岛固定后，造影剂的标记情况图；A，INS-I细胞经多聚甲醛固定后，200ug/ml铁浓度下的PEG-SPIO及PEG-SPI0_Exendin4标记细胞lh，2h及4h，弃去造影剂并用PBS清洗三次，行普鲁士蓝染色；结果显示普通PEG-SPIO为能标记上固定的 INS-I细胞，而偶联exendin-4的SPIO则随孵育时间的延长，标记细胞数目逐渐增多。B,原代胰岛切片经固定后，给予200ug/ml SPI0-Exendin4孵育2h，PBS洗三次后行普鲁士蓝染色，提示SPIO-ExendiM同样可标记固定的胰岛细胞。图7是PEG-SPIO，SPI0_exendin4分别标记移植入肾包膜下的beta细胞切片普鲁士蓝染色照片；A，INS-I细胞移植入肾包膜下的HE染色图；B，C，200ug/ml铁浓度的PEG-SPIO标记胰岛移植物切片池后普鲁士蓝染色，结果显示PEG-SPIO未能标记胰岛移植物(C图为B 图的放大)；D，同等铁浓度的SPIO-ExendiM标记池后，普鲁士蓝染色显示肾小管未被标记，而E，F，胰岛细胞移植物可被SPIO-ExendiM标记(F图为E图中方框部分的放大)。图8是PEG-SPIO，SPI0_exendin4分别标记胰腺切片中的beta细胞普鲁士蓝染色照片；A，含胰岛的胰腺切片HE染色；B，C，D，200ug/ml铁浓度的SPIO-ExendiM标记原位胰岛池后，普鲁士蓝染色显示胰岛被SPIO-ExendiM标记，而周围外分泌腺则未被标记(C，D图为B图内胰岛的逐级放大显示)；E，F，G，显示另一例胰岛被SPIO-exendiM 有效标记，而周围外分泌腺则未被标记(F，G为E图内胰岛的逐级放大显示)，证明了 SPI0-Exendin4存在着靶向性。图9是PEG-SPI0，SPI0_exendin4分别注射入胰岛素瘤荷瘤裸鼠体内，MRI扫描成像T2WI图像；左图、中图、右图分别为未注射造影剂组、PEG-SPIO注射后24h及SPIO-exendiM 注射后MhMRI扫描T2WI图。结果显示胰岛素瘤荷瘤鼠分别通过尾静脉注射PEG-SPIO及 SPI0-exendin4 (3mgFe/kg)，24h 后 MRI 扫描成像(T2 map)。结果显示 SPI0_exendin4 可聚集于胰岛素瘤区域(表现为负性增强)，而PEG-SPIO则无靶向性。图10是PEG-SPIO，SPI0-exendin4注射不同组胰岛素瘤切片普鲁士蓝染色照片， 用于普鲁士蓝染色验证SPIO-exendiM对胰岛素瘤的靶向性。A，裸鼠胰岛素瘤荷瘤模型建立，可见肿瘤粗大的供应血管；B，C，胰岛素瘤荷瘤鼠通过尾静脉注射PEG-SPIO (3mg Fe/kg)，24h后切取肿瘤行普鲁士蓝染色，结果显示肿瘤区域无铁颗粒沉积(C图为B图框内部分的放大)；D，E，F，胰岛素瘤荷瘤鼠通过尾静脉注射 SPI0-exendin4 (3mg Fe/kg)，24h后切取肿瘤行普鲁士蓝染色，结果显示SPI0_exendin4可聚集于肿瘤部位(D图及F图分别为E图内框内部分的放大)。
具体实施例方式以下结合实施例进一步说明本发明。实施例1、一种exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPI0_exendin4纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤1)、在惰性气体Ar的保护下，于室温中将FeCl3 · 6H20和FeCl2 · 4H20按照2 1 的摩尔比溶解于聚乙二醇600(PEG600)中，得到黄褐色溶液；FeCl3 · 6H20在该黄褐色溶液中的摩尔浓度为0. 05M。2)、在惰性气体Ar的保护下，将上述步骤1)所得的黄褐色溶液升温至125°C， 加入一定量的去离子水和EDEA，在125°C保温30分钟，得黑色悬浮液。其中去离子水与 FeCl3 · 6H20 的摩尔比为 20 1，EDEA 与 FeCl3 · 6H20 的摩尔比为 300 1。
3)、将上述步骤2)所得的黑色悬浮液冷却至室温，加入甲苯5000rpm离心，甲苯与黑色悬浮液的体积比为1 1;去除上清液，得到棕色的氧化铁纳米颗粒(SPIO)(为粉末状固体)。4)、在惰性气体Ar保护下，将上述步骤3)得到的氧化铁纳米颗粒分散于甲苯中， 从而使氧化铁纳米颗粒的摩尔浓度为0. OlM ；然后在搅拌的条件下，加入一定量的APS和钛酸丁酯，加热至80°C，回流反应10小时。APS与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为20 1，钛酸丁酯与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为5 1。5)、将上述步骤4)反应结束所得的溶液冷却至室温5000rpm离心分离，用甲苯清洗3 5次去除残余未反应的APS或者钛酸丁酯，得到APS修饰的SPIO (APS-SPIO)的棕色粉末。每次清洗时甲苯的用量与反应溶液体积相同。将得到的APS-SPIO分散于甲苯中，从而使APS-SPIO的浓度为0. OlM0在室温中于30KHz的超声清洗机中超声，并机械搅拌，加入双羧基PEG和DCC，反应3小时后，再加入 EDEA，在室温中于超声及机械搅拌下继续反应5小时。其中双羧基PEG与APS-SPIO的摩尔比为3 1，DCC与APS-SPIO的摩尔比为10 1 ;EDEA与APS-SPI0的摩尔比为3 1。6)、将步骤5)所得的产物5000rpm离心，依次用乙醇和去离子水清洗，得到 PEG-SPIO。将PEG-SPIO分散于磷酸盐缓冲溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS缓冲溶液)，得PEG-SPIO的PBS溶液，其浓度约为6毫克PEG-SPIO每毫升，即！^e元素浓度约为6 毫克每毫升(其准确狗元素的浓度一般用原子吸收光谱测得，以下浓度均用元素浓度表不)O7)、将摩尔比1 2. 5的EDC与NHS混合，得混合物。取1毫升!^e元素浓度为6毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量 exendin-4水溶液与上述混合物(即摩尔比1 2. 5的EDC与NHS混合而得)，常温下搅拌反应10小时，exendin-4 /K溶液中exendin-4的浓度为1毫克每毫升，exendin-4与Fe元素的质量比为1 1，PEG-SPIO与EDC的摩尔比为1 2。exendin-4通过表面的羧基与 PEG-SPIO表面的氨基通过缩水反应连结到PEG-SPIO表面，通过3kDa的超滤管超滤，将可能残存的EDC与NHS及反应副产物去除，得到最终的SPI0-exendin4。实施例2、一种exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPI0_exendin4纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤1)、在惰性气体的保护下，于室温中将!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黄褐色溶液；FeCl3*6H20 与 FeCl2*4H20 的摩尔比为 2 1，FeCl3 ·6Η20 在黄褐色溶液中的浓度为0. 05Μ。2)、在惰性气体的保护下，将步骤1)所得的黄褐色溶液升温至125°C，加入一定量的去离子水和EDEA，在125°C保温30分钟，得黑色悬浮液。其中去离子水与FeCl3 ·6Η20的摩尔比为20 1，EDEA与FeCl3 ·6Η20的摩尔比为300 1。3)、将步骤2)所得的黑色悬浮液冷却至室温，加入甲苯5000rpm离心，去除上清液，得到棕色氧化铁纳米颗粒(SPIO)粉末状固体。其中甲苯与反应溶液的体积比为1 1。4)、在惰性气体保护下，将步骤3)得到的氧化铁纳米颗粒分散于甲苯中，使氧化铁纳米颗粒的浓度为0.01M，然后在搅拌的情况下，加入一定量的APS和钛酸丁酯，加热至80°C，回流反应12小时。APS与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为20 1，钛酸丁酯与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为1 1;5)、将上述反应结束的溶液冷却至室温并5000rpm离心分离，用甲苯清洗3 5次去除残余未反应的APS或者钛酸丁酯，每次清洗时甲苯的用量与反应溶液体积相同。得到 APS修饰的SPIO(APS-SPIO)棕色粉末。将得到的APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的浓度为0. 01M，于室温中在超声及机械搅拌下，加入双羧基PEG和DCC，反应4小时后，加入EDEA，于室温中在超声及机械搅拌下，继续反应4小时。其中双羧基PEG与APS-SPIO的摩尔比为3 1，EDEA与APS-SPIO 的摩尔比为3 1，DCC与APS-SPIO的摩尔比为10 1。 6)、将步骤5)得到的产物5000rpm离心，用乙醇和去离子水依次清洗，得到 PEG-SPI0，并分散于磷酸盐缓冲溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS缓冲溶液)，得到 PEG-SPIO的PBS溶液；其浓度约为6毫克PEG-SPIO每毫升，即，PEG-SPIO的PBS溶液中！^e
元素浓度为6毫克/毫升。7)、取1毫升!^e元素浓度为6毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量 exendin-4水溶液与摩尔比1 2. 5的EDC与NHS的混合物，exendin-4水溶液中exendin_4 的浓度为1毫克每毫升，常温下搅拌反应10小时，exendin-4通过表面的羧基与PEG-SPIO 表面的氨基通过缩水反应连结到PEG-SPIO表面，通过3kDa的超滤管超滤，将可能残存的 EDC与NHS及反应副产物去除，得到最终的SPI0-exendin4。其中，exendin-4与!^e元素的质量比为1 1，PEG-SPIO与EDC的摩尔比为1 2。实施例3、一种exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPI0_exendin4纳米颗粒)的制备方法，依次进行以下步骤1)、在惰性气体的保护下，于室温中将!^eCl3 ·6Η20和FeCl2 ·4Η20溶解于聚乙二醇 600 (PEG600)中，得到黄褐色溶液；FeCl3*6H20 与 FeCl2*4H20 的摩尔比为 2 1，FeCl3 ·6Η20 在黄褐色溶液中的浓度为0. 1Μ。2)、在惰性气体的保护下，将上述黄褐色溶液升温至135°C，加入一定量的去离子水和EDEA，在135°C保温40分钟，得黑色悬浮液；去离子水与FeCl3 · 6H20的摩尔比为 15 1，EDEA 与 FeCl3 · 6H20 的摩尔比为 200 1。3)、将反应得到的黑色悬浮液冷却至室温，加入甲苯5000rpm离心，去除上清液， 得到棕色氧化铁纳米颗粒(SPIO)粉末状固体。甲苯与黑色悬浮液的体积比为3 1。4)、在惰性气体保护下，将得到的氧化铁纳米颗粒分散于甲苯中，使氧化铁纳米颗粒的浓度为0. OlM ；然后在搅拌的情况下，加入一定量的APS和钛酸丁酯，加热至80°C，回流反应12小时。APS与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为10 1，钛酸丁酯与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为3 1。5)、将上述步骤4)反应结束的溶液冷却至室温并5000rpm离心分离，用甲苯清洗 3 5次去除残余未反应的APS或者钛酸丁酯，得到APS修饰的SPIO (APS-SPIO)棕色粉末， 每次清洗时甲苯的用量与反应溶液体积相同。将得到的APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的浓度为0. 02M ；然后于室温中在超声及机械搅拌下，加入双羧基PEG和DCC，反应5小时后，再加入EDEA，于室温中在超声及机械搅拌下，继续反应3小时。其中双羧基PEG与APS-SPIO的摩尔比为4 1，EDEA与
9APS-SPIO的摩尔比为4 1，DCC与APS-SPIO的摩尔比为10 1。6)、将得到的产物5000rpm离心，依次用乙醇和去离子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸盐缓冲溶液中(Phosphate Buffered Saline PBS缓冲溶液)，得到PEG-SPI0的 PBS溶液；其浓度约为4毫克PEG-SPIO每毫升，即!^e元素浓度约为4毫克每毫升。7)、取2毫升的上述!^e元素浓度为4毫克每毫升的PEG-SPIO的PBS溶液，加入一定量exendin-4水溶液与摩尔比1 2. 5的EDC与NHS的混合物，exendin-4水溶液中 exendin-4的浓度为1毫克每毫升，常温下搅拌反应10小时，exendin-4通过表面的羧基与 PEG-SPIO表面的氨基通过缩水反应连结到PEG-SPIO表面，通过3kDa的超滤管超滤，将可能残存的EDC与NHS及反应副产物去除，得到最终的SPI0-exendin4。其中，exendin-4与!^e 元素的质量比为0.5 1，PEG-SPIO与EDC的摩尔比为1 3。实施例4、SPI0-exendin4纳米颗粒体外标记大鼠胰岛素瘤细胞系INS-I细胞 (一)(1)将大鼠INS-I细胞以8X IO4个种入M孔板中，生长Mh。(2)将制备的PEG-SPIO及SPI0_exendin4纳米颗粒用RPMI-1640培养基稀释，Fe 浓度为100ug/ml。(3)在含INS-I细胞的M孔板中加入上述各组含纳米颗粒的培养基500ul，孵育 Ia1行普鲁士蓝染色。结果为普鲁士蓝染色显示PEG-SPIO孵育12h，INS-I细胞被标记效率较低；而 SPI0-exendin4在100ug/ml Fe浓度下则可有效标记INS-I细胞。具体如图6_1所示。从上述结果证实靶向性SPIO-exendiM比PEG-SPI0具有更高的beta细胞标记效率。实施例5、SPI0-exendin4纳米颗粒体外标记大鼠胰岛素瘤细胞系INS-I细胞 (二)(1)将大鼠INS-I细胞以8X IO4个种入M孔板中，生长24h后，用4%多聚甲醛室温固定20min ；(2)将制备的PEG-SPIO与SPI0_exendin4纳米颗粒用RPMI-1640培养基稀释，铁浓度为200ug/ml。(3)在含固定的INS-I细胞的M孔板中分别加入上述各组含纳米颗粒的培养基 500ul，孵育1，2，4h后行普鲁士蓝染色。结果为不论孵育时间长短，PEG-SPIO均不能标记上固定的beta细胞，而 SPI0-exendin4可有效标记固定的beta细胞，且随着时间的延长，被标记细胞数目逐渐增多。具体如6-2所示。从上述结果可以得知SPI0-exendin4不仅对活的beta细胞具有较高标记效率， 对固定的beta细胞仍可通过配受体结合而较好的实现标记。实施例6、SPI0-exendin4标记beta细胞移植物及胰腺内原位胰岛(1)收集2 X IO6个INS-I细胞，并将其移植入C57BL/6小鼠肾包膜下，一周后取出beta细胞移植物及胰腺，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋、切片(层厚 4um) ο(2)将制备的PEG-SPIO与SPI0_exendin4纳米颗粒用RPMI-1640培养基稀释，铁浓度为200ug/ml。(3)将上述混合液同胰腺切片及beta细胞移植物孵育池后，行普鲁士蓝染色。结果为=PEG-SPIO不能够标记切片上的beta细胞移植物及胰腺内胰岛；而 SPI0-exendin4则可标记beta细胞移植物及胰腺内胰岛，而不标记肾小管等beta细胞移植物周边组织及胰腺外分泌腺。具体如图7，图8所示。从上述结果可以得知制备的SPIO-exendiM对beta细胞移植物及胰腺内胰岛可实现良好的标记，且表现出对beta细胞的特异性。实施例7、SPI0-exendin4对胰岛素瘤的体内靶向MRI显像(1)收集2X IO7个INS-I细胞，注射入4周龄裸鼠腋下，建立胰岛素瘤裸鼠荷瘤模型。(2)将建瘤成功的裸鼠称重，腹腔注射50mg/kg的戊巴比妥钠以麻醉小鼠。在 3. OTesla 的临床MRI 上，用小鼠线圈进行扫描。TR/TE = 200/8ms,Number of averages = 32, FOV = 3. 2X3. 2cm2, matrix size = 256X 256, resolution = 0. 125X0. 125mm2, slice thickness = 0. 5mm。(3)不同组荷瘤鼠通过尾静脉注射入PEG-SPIO或SPI0_exendin4 C3mgFe/kg)，Mh 后进行MRI扫描，参数基本同(2)。将不同组荷瘤裸鼠的肿瘤进行石蜡切片，H&E染色及普鲁士蓝染色。结果为胰岛素瘤在MRI T2加权上表现为高信号，PEG-SPIO注射后Mh，胰岛素瘤信号无明显改变，而在SPIO-exendiM注射后，胰岛素瘤产生明显信号改变，呈现负性增强(即颜色变黑)。普鲁士蓝染色结果显示，PEG-SPIO注射组胰岛素瘤内未见明显铁颗粒沉积，而在SPIO-exendiM注射组，肿瘤内可见较多铁颗粒聚集。具体如图9，图10所示。从上述结果可以得知SPI0-exendin4可靶向胰岛素瘤，实现胰岛素瘤在MRI上的靶向成像。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是依次进行以下步骤1)、在惰性气体的保护下，于室温中将FeCl3· 6H20和FeCl2 · 4H20溶解于聚乙二醇600 中，得到黄褐色溶液；所述FeCl3 · 6H20与FeCl2 · 4H20的摩尔比为2:1，FeCl3 · 6H20在黄褐色溶液中的浓度为0. 01 0. IM ；2)、在惰性气体的保护下，将步骤1)所得的黄褐色溶液升温至120 140°C，然后加入去离子水和2，2’ -(乙烯二氧)双(乙胺)，在120 140°C保温30 60分钟，得黑色悬浮液；所述去离子水与 ^α3·6Η20的摩尔比为30 10 :1，2，2’-(乙烯二氧)双(乙胺)与 FeCl3 · 6Η20 的摩尔比为 200 400 :1 ；3)、将步骤2)所得的黑色悬浮液冷却至室温，加入甲苯离心，去除上清液，得到棕色的氧化铁纳米颗粒；所述甲苯与黑色悬浮液的体积比为1 3 :1 ；4)、在惰性气体保护下，将步骤3)所得的氧化铁纳米颗粒分散于甲苯中，使氧化铁纳米颗粒的浓度为0. 005 0. 05Μ ；然后在搅拌的情况下，加入3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺和钛酸丁酯，加热至70 90°C，回流反应10 16小时；3-(三甲氧基甲硅烷基)-1-丙胺与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为5 30 :1，钛酸丁酯与氧化铁纳米颗粒的摩尔比为1 5 :1 ；5)、将步骤4)反应结束所得的溶液冷却至室温并离心分离，用甲苯清洗，得到 APS-SPIO ；将所述APS-SPIO分散于甲苯中，使APS-SPIO的浓度为0. 005 0. 05M ；然后于室温中在超声及机械搅拌下，加入双羧基PEG和二环己基碳二亚胺，反应3 5小时后，所述双羧基PEG与APS-SPIO的摩尔比为1 5 :1，二环己基碳二亚胺与APS-SPIO的摩尔比为5 20 1 ；上述反应结束后，再加入2，2’ -(乙烯二氧)双(乙胺)，于室温中在超声及机械搅拌的条件下继续反应3 5小时；所述2，2’ -(乙烯二氧)双(乙胺)与APS-SPIO的摩尔比为 1 5 :1 ；6)、将步骤5)所得的产物离心，用乙醇和去离子水清洗，得到PEG-SPI0，并分散于磷酸盐缓冲溶液中，得到PEG-SPIO的PBS溶液；所述PEG-SPIO的PBS溶液中！^元素浓度为3 7毫克/毫升；7)、将摩尔比1 2. 5的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺混合，得混合物；取步骤6)所得的部分的PEG-SPIO的PBS溶液加入exendin-4水溶液和上述混合物，于常温下搅拌反应8 12小时，从而使exendin-4通过表面的羧基与PEG-SPIO表面的氨基通过缩水反应连结到PEG-SPIO表面；再通过超滤，最终得到的SPIO-exendiM ；所述 exendin-4与Fe元素的质量比为0. 5 1. 5 :1，PEG-SPIO与EDC的摩尔比为1 :2 4。
2.根据权利要求1所述的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是所述步骤2)在搅拌条件下进行。
3.根据权利要求1或2所述的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其特征是所述惰性气体为Ar。
4.如权利要求1 3中任意一种方法制备的Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的用途，其特征是用于胰岛beta细胞的标记及胰岛素瘤的靶向显像。
全文摘要
本发明公开了一种Exendin-4偶联的超顺磁性氧化铁纳米颗粒的制备方法，其采用高温水解金属醇盐螯合物过程制备出SPIO纳米颗粒，应用APS对SPIO进行硅烷化修饰及PEG对APS-SPIO颗粒进行表面包被，得到PEG-SPIO，进一步采用NHS/EDC方法将exendin-4偶联于PEG-SPIO上，从而得到具有beta细胞靶向性的纳米材料SPIO-exendin4。采用本发明方法制备而得的SPIO-exendin4能用于胰岛素瘤的靶向显像，并可提高SPIO对beta细胞的标记效率。
文档编号B82Y30/00GK102249345SQ20111008393
公开日2011年11月23日 申请日期2011年4月2日 优先权日2011年4月2日
发明者吴育连, 张波, 翟传鑫 申请人:浙江大学