一种具有fret效应的金纳米粒子二聚体的组装方法
【专利摘要】一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，属于材料化学【技术领域】。本发明包括金纳米粒子合成，金纳米粒子功能化修饰，金纳米粒子上修饰荧光染料，金纳米粒子二聚体组装，FRET效应的产生及其表征。本发明通过在金纳米粒子上修饰功能化的PEG分子SH-PEG-COOH，并再在PEG上修饰荧光染料。利用PEG分子链状结构性质使得在贵金属纳米粒子表面周围的荧光染料也能表现出一定的荧光强度。同时，利用DNA可控自组装技术，将修饰有不同荧光染料的金纳米粒子组装成二聚体，使得两种荧光染料之间的距离能够进一步拉近，从而产生FRET效应。本发明得到了结构均一，荧光产率高的金纳米粒子二聚体。
【专利说明】一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法
【技术领域】
[0001] 一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，属于材料化学【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 荧光共振能量转移（FRET)是指距离小于IOnm的两个荧光分子间产生的一种能量 转移现象。供体的能量传递给临近的受体使得其自身荧光强度发生大幅度的降低，而受体 的荧光强度大大增强。金纳米粒子作为一种贵金属纳米材料，其本身就会猝灭周围存在的 荧光分子。但是，金纳米粒子良好的生物相容性以及可控的尺寸是研究生物体中分子之间 相互作用以及生物医学治疗理想基质。通过在金纳米粒子上形成FRET，不仅能够作为组装 体纳米材料显著的佐证，而且能为纳米材料在生物体中的变化规律、运动轨迹提供可靠依 据。
[0003] 本发明包括金纳米粒子合成，金纳米粒子功能化修饰，金纳米粒子上修饰突光染 料，金纳米粒子二聚体组装，FRET效应的产生及其表征。本发明通过在金纳米粒子上修饰功 能化的PEG分子，并再在PEG上修饰荧光染料。利用PEG分子链状结构性质使得在贵金属纳 米粒子表面周围的荧光染料也能表现出一定的荧光强度。同时，利用DNA可控自组装技术， 将修饰有不同荧光染料的金纳米粒子组装成二聚体，使得两种荧光染料之间的距离能够进 一步拉近，从而产生FRET效应。
【发明内容】
[0004] 本发明公开了一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，得到了结构 均一，荧光产率高的金纳米粒子二聚体。
[0005] 本发明的技术方案：一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法， 具体工艺步骤为： (1) 金纳米粒子合成 柠檬酸还原法合成金纳米粒子； (2) 金纳米粒子功能化修饰 步骤（1)中合成的金纳米粒子与一端带有巯基另一端带有羧基MW 5000的双功能基团 修饰的聚乙二醇分子SH-PEG-C00H偶联，形成Au-PEG-COOH复合体； (3) 金纳米粒子上修饰荧光染料 将步骤（2)中的Au-PEG-COOH复合体分别与荧光染料Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 647偶联，形成Au-AF 594和Au-AF 647复合体； (4) 金纳米粒子二聚体组装 将步骤（3)中的Au-AF 594及Au-AF 647复合体分别与DNAl，DNA2偶联，形成Au-AF 594-DNA1 复合体及 Au-AF 647- DNA2 复合体；将 Au-AF 594-DNA1 复合体和 Au-AF 647- DNA2复合体杂交，形成金纳米粒子二聚体； DNAl :5' -CAATAGCCCT TGGATAAAAA AAAAA-SH-3'， DNA2 :5' -ATCCAAGGGC TATTGAAAAA AAAAA-SH-3' ； (5) FRET效应的产生及其表征 将步骤（4)中的金纳米粒子二聚体与仅有一端带有巯基修饰的PEG (MW 5000)溶液混 匀，得到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体，并对其进行透射电镜和荧光表征。
[0006] 所述金纳米粒子的合成： 在洁净的三角烧瓶中加入195mL超纯水，再加入5mL 4g/L的三水合四氯金酸溶液，力口 热，煮沸lOmin，然后加入3. 6mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从 淡黄色变成酒红色，持续沸腾反应30 min至颜色不再发生变化。最后，冷却至室温，即制得 20nm左右的金纳米粒子。
[0007] 所述金纳米粒子功能化修饰： 取ImL所述新制的20nm左右金纳米粒子，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于 900 ii L含0.05%吐温20的超纯水中；再向其中加入15 ii L 20 ii M的双功能基团修饰的PEG 分子 SH-PEG-COOH，SH-PEG-COOH 是从 Laysan Bio, Inc 公司买的，60°C水浴 2h，冷却至室 温，得到Au-PEG-COOH复合体。
[0008] 所述金纳米粒子上修饰荧光染料： 将所述得到的Au-PEG-COOH复合体8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于ImL pH4. 7 的2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液（MES)中，将IOii L ImM碳二亚胺（EDC)与IOii L IOmM琥 珀酰亚胺（NHS)加入到Au-PEG-COOH复合体溶液中，室温静置4h ;然后，分别取500 ii L活 化后的Au-PEG-COOH复合体，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500 y L I y M Alexa Fluor 594 (pH9. 6)及 500 ii L IiiM Alexa Fluor 647 (pH9. 6)荧光染料中，室温避 光静置12h后得到Au-AF 594复合体及Au-AF 647复合体。
[0009] 所述金纳米粒子二聚体组装： 将所述得到的Au-AF 594复合体与DNAl按摩尔浓度比为1 : 5混匀，Au-AF 647复 合体与DNA2按摩尔浓度比为1 : 5混匀，分别室温静置12h后，8500rpm离心15min，去上 清，沉淀分别重悬于500 ii L含0. 05%吐温20的超纯水中，得到Au-AF 594-DNA1复合体及 Au-AF 647- DNA2复合体；然后将得到的两种复合体等体积混匀，室温避光反应12h，得到 金纳米粒子二聚体。
[0010] 所述FRET效应的产生及其表征： 将仅有一端带有巯基修饰的PEG溶液(分子量5000)按摩尔浓度比Au : PEG为 1 : 1000加入到上述修饰有荧光染料的金纳米粒子二聚体溶液中，室温避光反应8h后， 8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于含0. 05%吐温20的超纯水中，得到能够产生FRET 效应的金纳米粒子二聚体；取200 ii L样品加入到比色皿中，将激发波长设定在594nm对其 进行荧光发射光谱表征；另取IOu L的上述金纳米粒子二聚体滴加到碳膜支持膜上，进行 透射电镜表征。
[0011] 所述DNA的编号、序列及长度如表1所示。
[0012] 表I DNA的编号、序列及长度 CN 104308182 A m Ti 3/4 页
【权利要求】
1. 一种具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于工艺步骤为： (1) 金纳米粒子合成 柠檬酸还原法合成金纳米粒子； (2) 金纳米粒子功能化修饰 步骤（1)中合成的金纳米粒子与一端带有巯基另一端带有羧基MW 5000的双功能基团 修饰的聚乙二醇分子SH-PEG-COOH偶联，形成Au-PEG-COOH复合体； (3) 金纳米粒子上修饰荧光染料 将步骤（2)中的Au-PEG-COOH复合体分别与荧光染料Alexa Fluor 594及Alexa Fluor 647偶联，形成Au-AF 594及Au-AF 647复合体； (4) 金纳米粒子二聚体组装 将步骤（3)中的Au-AF 594及Au-AF 647复合体分别与DNAl，DNA2偶联，形成Au-AF 594-DNA1 复合体及 Au-AF 647- DNA2 复合体；将 Au-AF 594-DNA1 复合体和 Au-AF 647-DNA2复合体杂交，形成金纳米粒子二聚体； DNAl :5' -CAATAGCCCT TGGATAAAAA AAAAA-SH-3'， DNA2 :5' -ATCCAAGGGC TATTGAAAAA AAAAA-SH-3' ； (5) FRET效应的产生及其表征 将步骤（4)中的金纳米粒子二聚体与仅有一端带有巯基修饰的PEG-5000溶液混匀，得 到能够产生FRET效应的金纳米粒子二聚体，并对其进行透射电镜和荧光表征。
2. 根据权利要求1所述具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于所 述金纳米粒子的合成： 在洁净的三角烧瓶中加入195mL超纯水，再加入5mL 4g/L的三水合四氯金酸溶液，力口 热，煮沸lOmin，然后加入3. 6mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从 淡黄色变成酒红色，持续沸腾反应30 min至颜色不再发生变化；最后，冷却至室温，即制得 20nm级的金纳米粒子。
3. 根据权利要求1所述具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于所 述金纳米粒子功能化修饰： 取ImL所述新制的20nm级金纳米粒子，8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于 900 ii L含0.05%吐温20的超纯水中；再向其中加入15 ii L 20 ii M的双功能基团修饰的PEG 分子SH-PEG-C00H，60°C水浴2h，冷却至室温，得到Au-PEG-COOH复合体。
4. 根据权利要求1所述具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于所 述金纳米粒子上修饰荧光染料： 将所述得到的Au-PEG-COOH复合体8500rpm离心15min，去上清，沉淀重悬于ImL pH4. 7 的2- (N-吗啡啉）乙磺酸MES缓冲液中，将10 ii L ImM碳二亚胺EDC与10 ii L IOmM琥珀酰 亚胺NHS加入到Au-PEG-COOH复合体溶液中，室温静置4h ;然后，分别取500 ii L活化后的 Au-PEG-COOH复合体，8500rpm离心15min，去上清，沉淀分别重悬于500iiL IiiM pH 9. 6 Alexa Fluor 594及 500 ii L IiiM pH 9.6 Alexa Fluor 647 荧光染料中，室温避光静置 12h 后得到Au-AF 594复合体及Au-AF 647复合体。
5. 根据权利要求1所述具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于所 述金纳米粒子二聚体组装： 将所述得到的Au-AF 594复合体与DNAl按摩尔浓度比为I:5混匀，Au-AF 647复 合体与DNA2按摩尔浓度比为1:5混匀，分别室温静置12h后，8500rpm离心15min，去上 清，沉淀分别重悬于500 ii L含0. 05%吐温20的超纯水中，得到Au-AF 594-DNA1复合体及 Au-AF 647- DNA2复合体；然后将得到的两种复合体等体积混匀，室温避光反应12h，得到 金纳米粒子二聚体。
6.根据权利要求1所述具有FRET效应的金纳米粒子二聚体的组装方法，其特征在于所 述FRET效应的产生及其表征： 将仅有一端带有巯基修饰的PEG-5000溶液按摩尔浓度比Au : PEG为1:1000加 入到上述修饰有荧光染料的金纳米粒子二聚体溶液中，室温避光反应8h后，8500rpm离心 15min，去上清，沉淀重悬于含0. 05%吐温20的超纯水中，得到能够产生FRET效应的金纳米 粒子二聚体；取200y L样品加入到比色皿中，将激发波长设定在594 nm对其进行荧光发射 光谱表征；另取IOu L的上述金纳米粒子二聚体滴加到碳膜支持膜上，进行透射电镜表征。
【文档编号】B82Y40/00GK104308182SQ201410565114
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】徐丽广, 胥传来, 孙茂忠, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学