专利名称：检测冻存生物样品质量的检测方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过测定冻存生物样品降温曲线来检测其质量的检测方法和装置，特别涉及一种利用半导体制冷装置对冻存生物样品实施降温进而观察其温度随时间变化的降温曲线与该样品标准降温曲线之间的偏离度来定量检测冻存生物样品质量的方法和装置。
低温生物学是近年来新兴并得到迅猛发展的交叉学科，随着研究的深入，其在各行各业的应用引人注目。医学方面，冷冻保存医用生物材料并进行移植是当前低温医学中最活跃的领域之一。医用生物材料的冷冻保存包括血液细胞、造血细胞、生殖细胞的冷冻保存；皮肤、角膜、骨与软骨、心脏瓣膜和大血管、内分泌腺以及器官等的低温保存。在农、林、医药、食品等行业中，低温生物学也为此带来了巨大的效益，比如在挽救濒危珍稀植物、保护生物等方面也产生了深远的影响。
生物材料可以在低温下长期保存，但却极易在对其降温和复温过程中受溶液冻结、融化，以及溶液渗透压力变化等因素的作用而损害。因而，在各类生物样品的冷冻与复温过程中，一方面，建立合适的降温程序是成功保存生物材料的关键因素，另一方面，成功的冻存技术还必须包括对冻存的生物材料质量进行快速、准确的检测，否则该冻存技术就没有普及推广意义。比如，快速、准确测定冻存后的胎肝细胞的活力，是胎肝细胞冷冻保存中的重要问题，因为这关系到该胎肝细胞能否进行移植和移植后能否重新建造造血功能(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)。所以，对冻存生物材料质量的的检测在低温生物医学的研究和应用中必不可少。
在刘金刚和刘作斌主编的低温医学(北京人民卫生出版社，1993)及李广武、郑从义和唐斌主编的低温生物学(长沙湖南科学技术出版社，1998)中，就各种冻存生物样品质量的检测方法进行了介绍对冻存卵胚胎活力的检测方法包括
1.形态学观察将冻存后复温的胚卵置于实体显微镜或相差显微镜下，观察胚卵的透明带是否完整、卵裂球轮廓是否清晰，大小是否均匀，是否晶莹透亮；有无变性(即胞质呈细颗粒状，轮廓模糊)、卵周间隙增大等。但这种观察只能对复温后的胚卵状况作出初步判断，而且，检定结果难免因人而异，在定量和客观性方面差。
2.冻存后胚卵进行体外培养，根据不同发育阶段的形态改变而计算出体外发育率。显然，这一过程操作周期长，复杂繁琐。
3.胚胎移植将冻存后复温的胚卵进行胚胎移植，观察胚胎体内发育情况，如受体的妊娠率，胚胎的植入率，产仔率等。该检定程序也相当费时，且操作并非易事。
4.快速荧光活体试验，但操作复杂，仪器昂贵。
对冻存红细胞质量检测分体外和体内检测两种方法(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)包括体外检查方法红细胞形态、计数、血红蛋白含量、糖、乳酸、有机磷化物转变为无机磷化物(ATP)2，3-DPG和K+，Na+的分布等，它们均涉及到一系列复杂的操作程序及昂贵仪器。国内常用的方法还有将ATP、2，3-DPG和红细胞酵解法(无氧酵解能力的测定)等通常酵解法作为判断标准，其方法是将正常人新鲜红细胞或者保存红细胞，用含糖的Tris-HCl任氏液洗涤3次后，取一定量洗过的红细胞悬液于华伯(Warburg)仪反应瓶中，在华伯仪恒定的条件下[温度38±0.10℃，pH7.43-7.46，无氧状态(N2)，振荡100±2次/每分钟，孵育5小时]进行重营代谢，观察孵育5小时过程中所消耗的葡萄糖量以及产生的乳酸量，以判断红细胞的无氧酵解能力，从而估计红细胞的质量。显而易见，该过程也相当繁琐。
冻存红细胞质量的体内检查法是一定量的保存红细胞输入体内后，有些在输注后是不能活的，这些丧失了生理功能的红细胞在受血者身体里24-48小时内消失，因此可以通过红细胞输入体内一定时期后存留于血流中的成活细胞的百分比，即所谓输注后的存活率来估计保存红细胞的质量。测定红细胞在体内存活率的方法有同位素标记法和免疫法。同位素方法常用51Cr法，其标记物是放射性铬，一般以铬酸盐形式使用，这种化合物的阴离子在体外能迅速地被红细胞摄取，进入红细胞后，铬从六价被还原为三价，以此形式与细胞内血红蛋白分子紧密结合。但超量的铬酸盐会对红细胞产生明显的损伤。所以此法并非理想。
对冻存白细胞质量检测由于白细胞的生理功能较为复杂以及在体外消失较快，所以目前还没有一种有效方法来检测白细胞在离开体内循环后的体外存活率。现行的冻存后复温的白细胞质量检测方法大致有颜料排斥法、吞噬能力测定法、测定细胞呼吸的酵解法、以及同位素标记法等(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)，其方法十分均复杂、定量程度低。
对冻存后血小板质量检测方法很多，但却未有比较可靠而又统一的方法。大体也分体内检测和体外检测两种途径(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)对冻存血小板质量的体外检测方法有凝血酶原消耗时间的测定、血块收缩能力、血小板的计数和形态的观察、血小板聚集、血小板旋转等。
对冻存血小板质量的体内检测方法测定血小板体内回收率有同位素法和非同位素法。同位素法在体外标记血小板，然后再回输入供血者体内，在一定的时间内测定循环中同位素的放射性，获得血小板在体内转换的数据，并得到血小板的存活率和回收率。非同位素法是通过阿斯匹林对血小板环氧化酶的不可逆性抑制，测定血小板代谢产物的生成量，籍以间接得到血小板在体内的存活期。
对冻存角膜质量的检测方法中，有一种值得注意，即温度逆转法(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)，其原理是角膜内皮的液泵作用是一种主动过程，需要能量消耗。当将角膜置于15℃以下环境中，酶的活性下降，供给内皮所需要的能量减少，液泵功能降低使角膜实质内水份潴留、水肿。此时，若将角膜重新置于34℃-37℃环境中，水肿很快消失。如果内皮细胞本身丧失活性，恢复温度也不能使角膜水肿消失。如温度逆转后2小时内角膜厚度减少25μm，表明角膜内皮功能良好。但这种方法对角膜水肿的判断主要取决于实验者的经验，并需要利用一系列的观察仪器，而且，该法主要适用于角膜质量的判定，其他生物样品并不一定体现出上述所介绍的角膜的酶特性。
除以上数种典型生物样品的质量检测方法外，在其他材料如胎肝细胞、骨髓、细胞株和医用菌种、皮肤、角膜、骨组织等方面也都有各自相应的判定方法(刘金刚，刘作斌主编，低温医学，北京人民卫生出版社，1993)，因内容众多，这里不一而足。总的来说，迄今在冻存生物样品质量的检测方法上已取得很大成绩，促进了低温生物学的发展。但各法都存在客观定量性不够、检测周期长、操作程序复杂繁琐，仪器昂贵等不理想之处，而且，因样品特性的差异，至今没有一种普遍适用的方法。
纵览现有的一些检测冻存生物样品的方法，大多显得程序相当复杂而繁琐，影响因素多，客观性稍差，涉及仪器较多，且昂贵。因此，发展快速、廉价而有效的评定措施一直是低温生物医学领域内极具意义的课题。
本发明目的在于克服现有技术中检测冻存生物样品质量的方法存在的缺陷其检测方法大都比较复杂繁锁，所需设备仪器昂贵，而且不同的冻存生物样品需要采用不同的检测方法，缺乏通用性等缺陷，而提供一种操作十分简单，定量化程度高，检测结果准确，而且对所有冻存生物样品均适用的检测冻存生物样品质量的方法。
本发明的又一目的是提供一种适合本发明方法的结构简单紧凑，操作简便，成本低廉，适合于各大、中、小型医院及研究单位使用的检测冻存生物样品质量的检测装置。
本发明的实施方案如下本发明提供的检测冻存生物样品质量的方法，其特征在于，检测步骤为1.将待测冻存生物样品复温至室温温度；2.将经复温后的待测冻存生物样品和正常生物样品放入相同的降温环境中，在室温至零下30℃的范围内同时进行降温，同时测出待测冻存生物样品和正常生物样品的温度随时间变化的降温曲线，并进行比较，同一时刻与正常生物样品的温度差在0.1-5℃范围内的待测冻存生物样品为生物医学中质量合格的生物材料。
本发明提供的检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，包括一制冷器；一位于制冷器冷端的具有隔热功能的样品室，制冷器与样品室之间设有导热硅酯；放在样品室中的微型器皿，微型器皿的基底上镶嵌有温度传感器；所述的制冷器为由多级Peltier半导体制冷元件构成的平面制冷器；制冷器的发热面贴有散热肋片；散热肋片上设有可将散热肋片表面的热量移走的小型风扇；所述制冷器的电源为可调节电压大小的调节电源。
本发明提供的检测冻存生物样品质量的方法的机理为
我们知道，超过水冻结温度的低温对生物组织的影响同时体现在纳米(分子)及微米(细胞)尺度。如对于动物组织样品而言，最重要和易受到外界影响的部位是细胞膜，其典型尺寸约10nm。细胞膜的功能是将细胞内可控的环境与外界不可控的环境分离开，并调节细胞内部与其外环境之间的传质。生物样品的相变冻结温度强烈地依赖于细胞膜脂双层的组分、链长及饱和度，而细胞膜脂双层中的相变会影响其隔离细胞内外溶液并控制质量传输的功能，因而在低温保存生物样品的过程中，针对不同的降温冻结程序，生物样品内的细胞脂双层的组分、链长及饱和度等会发生对应的改变，由此导致样品的凝结点发生大的偏离。若对其冻结和复温是成功的，则该生物样品内细胞脂双层的组分、链长及饱和度应接近于正常生物样品，反之，破损生物样品的降温曲线则出现大的偏离。因而，取一定量经过冻结并复温后的样品再度进行降温，比较其降温曲线与正常样品降温曲线之间的偏离度，即可对所冻存的样品是否合乎移植要求作出定量检测。整个检测过程仅需一个降温测定过程，因而操作十分简单，定量化程度高，测试结果不因人而异，准确度较高，而且对所有冻存生物样品均适用，可成为一种检测冻存生物样品质量的通用方法。
基于对各类生物样品具有不同降温特性尤其是凝结点的规律，提出一种概念崭新的检测冻存生物样品质量的方法，可方便地通过观察生物样品温度随时间变化的降温曲线来达到检测冻存生物样品活性的目的，由此研制的仪器结构紧凑简单，操作简便，成本低廉，一般仅需有电源即可实现对生物样品质量作出判断，适合于各大、中、小型医院及研究单位使用，关于降温装置的选择，以往的作法大都采用制冷剂如液氮等来达到降温目的，但要用到一系列配套设施，如需制备、购买并保存液氮，液氮消耗量大，而液氮的制备需要专门的设备，且来源受到限制，这对于大多数医学生物学研究单位并不方便。并且，采用液氮容器如杜瓦瓶对生物样品进行降温无法实现复杂的降温程序。为此，在对各类制冷方式和现有设备的优缺点进行综合对比的基础上，本发明实施的仪器方案采用结构紧凑，响应速度快，成本低廉，且操作十分简便的半导体制冷器，其可方便地通过改变制冷器输入电压而对生物样品实施不同的降温速率，且连续性较好，操作简便。
下面结合附图及具体实施例进一步描述本发明
图1为本发明的结构示意图；图2为制冷器和样品室的示意图；图3为微型器皿的示意图；图4为半导体制冷器及其散热肋片的结构示意图；图5为冻结明胶与正常明胶的冻结降温曲线图；图6为冻结蛋清与正常蛋清的降温曲线对比图。
其中制冷器1支架2 样品室3微型器皿 4 样品室端盖5 温度传感器6Peltier半导体制冷元件9 散热肋片10A为冻结明胶的降温曲线 B为正常明胶的降温曲线C为冻结蛋清的降温曲线 D为正常蛋清的降温曲线由图可知，本发明提供的检测冻存生物样品质量的装置，包括制冷器1；位于制冷器1冷端的具有隔热功能的样品室3，制冷器1与样品室3之间设有导热硅酯；放在样品室1中的微型器皿4，微型器皿4的基底上镶嵌有温度传感器6；所述的制冷器1为由多级Peltier半导体制冷元件9构成的平面制冷器；制冷器1的发热面贴有散热肋片10；散热肋片10上设有可将散热肋片表面的热量移走的小型风扇(图中未示)；所述制冷器1的电源为可调节电压大小的调节电源。可将制冷器至于的支架2上，以利于制冷器的散热。
本发明的制冷器1采用由Peltier半导体制冷元件9构成，市场上极易购买到，将一系列这样的元件集成封装在两金属平板之间，则可形成具有一个加热面和一个制冷面的平面制冷器，Peltier半导体制冷元件可以多级串联以增大制冷或加热功率，以对生物样品实施冷却。一旦该集成的制冷器接通电源(与变压器连接，以获得安全电压和电流)，则一侧平面发热，另一侧降温，接冷端者即起制冷作用，用于对生物样品进行降温冻结，接发热端则为加热作用，通过改变电流方向可调整加热或制冷面的相对位置。但热面温度会很快上升，为避免温度过高并保证器件获得足够的降温能力，要尽量将产生的热量移走，本发明采用在制冷器发热面上紧贴一由高热导率制成的导热肋片10，并在散热肋片上布置有一小风扇进行鼓风，通过迫使肋片周围空气对流将肋表面上热量迅速移走，由此可保证整个装置的安全使用，整套散热装置完全类同于市场上容易购得的用于冷却计算机芯片的肋片散热器，因而只需购买使用即可。计算机8可对生物样品具体选定及实施一定的升温或降温程序，并对所获曲线作出判定。制冷器冷端温度传感器6镶嵌(或焊接)在微型器皿4的基底上，其温度信号由与计算机8连接的数据采集仪7记录，以测得降温过程中生物样品的降温曲线。该装置结构简单、成本低廉且操作十分简便。微型器皿4材料采用导热系数较高而毒性较小的金属银作成，以使制冷器的冷量迅速传至样品，从而达到快速的降温响应能力。为减小样品用量，微型器皿4尺寸控制在3mm×3mm×3mm到10mm×10mm×10mm之间。壁厚可在0.05-0.5mm之间。微型器皿4基底可直接搁置于制冷器的冷端，其间设置有导热硅脂，以保证良好的热耦合。可配备不同大小的样品室，供不同尺寸的生物样品的检测选用。
在进行冻存生物样品质量的时，用滴定管或其它容器取相同量的待测冻存生物样品和正常生物，分别置入微型器皿4中，并将盛有待测冻存生物样品的微型器皿4和盛有正常生物样品的微型器皿4同时置入样品室中，对其同时降温，开通数据采集仪，记录下降温过程，分别制出待测冻存生物样品和正常生物样品的温度随时间变化的降温曲线，然后对比其与正常生物样品标准降温曲线之间的温度差，温度差在0.1-5℃时的待测冻存生物样品属生物医学中质量合格的生物样品。
实施例1使用本发明的方法检测经液氮冷冻过的明胶质量明胶通常作为各种生物样品的替代物，这里用其作为实施例有一定代表性。事实上，对于真正的活体生物样品，其内由于活细胞的存在，当受到冻结时，其在物理性质上的改变更为显著，因而本方法更易于实现。本实施例实际上采用了一种难度更大的情况。取经过液氮冻结并复温到室温后的果冻状明胶和正常(未经冻结的处于室温下)果冻状明胶各50克，放在同样大小的铜器皿中，并置于相同的降温环境中，对两容器底部同时用经液氮预冷的铜棒(温度固定在-196℃)进行急速冷却降温，同时用设置于两容器底且朝向样品一侧的热电偶式温度传感器分别测出两者的温度随时间变化的降温曲线，由于记录曲线的时间较长，我们仅将记录到的部分结果显示于图1中。从中可见，在降温区间20℃到-20℃之间，两容器内样品在同一时刻的温度差最高可达20℃，开始时，二者能较好地保持相近的降温曲线，直至到达零度附近的相变点温度时，才开始发生大的偏离，且最大温差高达20℃，说明液氮冻结对明胶性能的影响极为显著。这是由于冻结过的明胶与正常明胶在微观结构上存在差异，因而必然导致二者在相变规律上发生明显改变，且偏离度越大，说明二者之间差异越大。而对于如细胞一类的生物样品，若待测样品与正常样品之间的差异越大，则说明待测样品的活性受到的损害越显著，因而移植效果越差。实验中，观察图1中两曲线对应的明胶样品，可以明显看出冻结过的明胶与正常即未冻结的明胶在颜色上发生了改变，明显发白，而正常者则呈水晶样透明状，进一步利用扫描电镜观察更容易地看出二者在微结构上发生了大的改变。
实施例2使用本发明的方法检测经液氮冷冻过的鸡蛋清的质量我们再取最常见的生物样品--鸡蛋清作同样实验。取两份新鲜鸡蛋清15毫克置于铜器皿中，对其中一份采用液氮冻结，可以看到瞬间形成小的冰球，伺其在空气中复温直至室温后。此时通过数据采集仪对两器皿中的鸡蛋清的温度同时进行监测，当二者温度趋于一致后，说明二者已达到相同状态。此时将两者同时放入本发明的装置的样品室中，开通半导体制冷器，则冻结过的蛋清及正常蛋清均发生降温。二者的降温曲线如图2所示，可以获得一个重要的结论，即尽管冻结蛋清和正常蛋清在起始的降温曲线重合，其在发生相变前后时的行为差别相当显著，两种样品在各自的相变点时均发生放热，具体表现为温度曲线出现如图2所示的上升台阶，此后在半导体制冷器的持续降温下则各自又逐渐下降，然而两种样品出现相变的起始和终了时刻差别相当显著如对于受冻结过的蛋清，其发生相变的时间约93s，而对于正常蛋清，发生相变的时间则在104秒，在此时间间隙内在同一时刻的两种蛋清的温度差最高可达10℃左右。说明液氮冻结对蛋清的损伤是显著的，其在降温过程中破坏了蛋清的微观结构以至造成了图2中的巨大差别。另外，对冻结过的鸡蛋加以煮熟后食用发现与煮熟的正常鸡蛋在口味上有明显差别，这说明温度差为10℃的鸡蛋已不能食用。
用上述同样的方法和过程检测经-20℃冷冻过的蛋清质量，通过降温曲线判定的结果其最大温度差为5℃，煮熟后发现与正常鸡蛋在外观及口味上无明显差别。
实施例3使用本发明的方法检测由冷库内取出的血液制品的质量对于由冷库内取出的血液制品，检测结果表明，将其与正常血液在从室温到零下30℃的范围内利用三级半导体制冷器同时进行降温，同时测出待测冻存血液样品和正常血液样品的温度随时间变化的降温曲线并进行比较，结合生物学方法活检后表明，在同一时刻与正常血液制品的温度差在0.1-5℃范围内的待测冻存血液制品，可以作为临床应用中质量合格的生物材料。
使用本发明的方法检测其他典型生物样品的质量可采用与实施例2相同的制冷与温度检测方法对如下生物样品卵胚细胞、白细胞、血小板及角膜等进行温度监测，同时采用各自的生物学活性检测方法检测，发现冻结样品与正常样品在从室温到零下30℃范围降温时的最大温度差在0.1-5℃时，活性均适宜于移植用。
实际上，对已有正常生物制品标准降温曲线的冻存样品，在进行检测时，只需将冻存样品置入和标准降温曲线相同的降温环境下，得出其降温曲线，并与标准降温曲线比较，即可检测其质量。
权利要求
1.一种检测冻存生物样品质量的方法，其特征在于，检测步骤为1)将待测冻存生物样品复温至室温温度；2)将复温后的待测冻存生物样品和正常生物样品放入相同的降温环境中，在室温至零下30℃的范围内同时进行降温，同时测出待测冻存生物样品和正常生物样品的温度随时间变化的降温曲线，并进行比较，同一时刻与正常生物样品的温度差在0.1-5℃范围内的待测冻存生物样品为生物医学中质量合格的生物材料。
2.一种检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，包括一制冷器；一位于制冷器冷端的具有隔热功能的样品室，制冷器与样品室之间设有导热硅酯；放在样品室中的微型器皿，微型器皿的基底上镶嵌有温度传感器。
3.按权利要求2所述的检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，所述的制冷器为由多级Peltier半导体制冷元件构成的平面制冷器。
4.按权利要求2所述的检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，所述的制冷器的发热面贴有散热肋片。
5.按权利要求4所述的检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，所述的散热肋片上设有可将散热肋片表面的热量移走的小型风扇。
6.按权利要求2所述的检测冻存生物样品质量的装置，其特征在于，所述制冷器的电源为可调节电压大小的调节电源。
全文摘要
一种检测冻存生物样品质量的方法,其步骤为:1)将待测冻存生物样品复温;2)将正常生物样品和复温后的待测冻存生物样品放入相同降温环境中,同时降温,分别同时测出其降温曲线,进行比较,同一时刻与正常生物样品的温度差在0.1－2℃范围内的待测冻存生物样品的质量合格,其装置包括:制冷器;位于制冷器冷端的样品室,放在样品室中的微型器皿,器皿基底上镶嵌有温度传感器,该方法简单,定量性和通用性高,装置易操作,适用范围广。
文档编号G01N25/02GK1367380SQ0110202
公开日2002年9月4日 申请日期2001年1月21日 优先权日2001年1月21日
发明者刘静, 张艳婷 申请人:中国科学院理化技术研究所