专利名称：检测dna及其类似物的衬底激活试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及在医学、生物化学、分子生物学研究中应用的衬底(substrate)激活试剂盒，也涉及应用该试剂盒检测DNA或蛋白质的方法。
背景技术：
基因分析在分子生物学和生物化学领域得到应用，最近又用于医学领域，比如诊断疾病。
最近发明了可以固定DNA的衬底，有力的促进了基因分析，该衬底也应用于医学领域以诊断疾病。
有一种使DNA固定在衬底上的方法是固定前将聚合物比如聚赖氨酸覆于玻璃载玻片表面或硅衬底上或利用半导体技术如光刻法将DNA合成到衬底上。
然而使用聚合物比如聚赖氨酸固定DNA的方法中存在由于DNA的不稳定固定状态而在杂交物形成步骤和漂洗步骤中造成DNA脱落的问题。
另一方面，使用半导体技术的方法要用到易出问题又复杂的生产工艺，使得该方法花费颇高。
为了解决上面提到的问题，我们已经发现通过化学方法修饰衬底表面即用活性酯，比如N-羟基琥珀酰亚胺酯或对硝基苯酚酯激活就可牢固的固定DNA。
但这种化学修饰法需要包括很多化学反应的复杂步骤。
另外，即便在衬底点上DNA以后，化学修饰激活的衬底上可能还有有害的活性点的存在。
因此，在目标DNA杂交到点样的DNA上后，有害的活性点也容许DNA自身沉积造成DNA精确检测的困难。
因而，本发明的目的是提供一个在衬底上以简单方式牢固固定DNA的方法，并且具有与传统方法同样高的DNA结合密度，本发明也提供了精确探测DNA及其类似物的方法，但克服上面提到的传统DNA固定方法中存在的问题。
发明内容
为实现上述目的我们努力工作，最终发现了只需混合两种溶液就可激活衬底。
我们还发现，通过在激活衬底和点样DNA或蛋白质之后、杂交以前的一个预杂交步骤中封闭有害的活性点，DNA或蛋白质可以得到精确的检测，从而完成本发明。我们还发现在点上样品后的激活(work-up)步骤中进行的干燥和清洗程序中当活性基团充分灭活时，可省略封闭。
此外，还发现在杂交或预杂交步骤之前的温育中使用一种胶体溶液(gel solution)可进一步提高DNA或蛋白质的检测精度。
依照本发明的衬底激活试剂盒主要包括由N-羟基琥珀酰亚胺和磷酸盐缓冲液(pH6)组成的溶液A和由1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺组成的溶液B。
依照本发明的的衬底激活试剂盒的第二个特征在于上述溶液A是浓度从0.01M到5M的磷酸盐缓冲液(pH6)和浓度从1mM到500mM(0.115g/L到57.5g/L)的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
依照本发明的衬底激活试剂盒的第三个特征在于上述溶液B是浓度从0.05M到10M(9.59g/L到1918g/L)的1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺的二噁烷溶液。
依照本发明的衬底激活试剂盒的第四个特征在于50％到99％体积百分比的上述溶液A和1％到50％体积百分比的上述溶液B共同使用。
依照本发明检测DNA或蛋白质的方法，包括在点样DNA或蛋白质至衬底(已用激活试剂盒活化)上后，但在用荧光称记的DNA与所述点样的DNA或蛋白质杂交之前的某一阶段，进行预杂交以封闭衬底表面中除点样位置外的其它位点。
依照本发明检测DNA或蛋白质的方法特征在于使用与点样至衬底表面的DNA或蛋白质不同的DNA或蛋白质进行预杂交。
依照本发明检测DNA或蛋白质的方法，包括用激活试剂盒激活衬底的步骤、将DNA或蛋白质点样到已激活的衬底上的点样步骤、点样后衬底的温育或干燥步骤、封闭衬底表面上除点样位置外其他部分的预杂交步骤、将荧光标记的DNA与点样的DNA或蛋白质杂交的杂交步骤和检测杂交位置中荧光位置的步骤。
依照本发明检测DNA或蛋白质的方法特征在于预杂交步骤是将不同于点样在衬底表面的DNA或蛋白质的DNA或蛋白质固定的过程。
附图简述
图1是衬底表面派生成活性酯的示意图。图2展示将DNA固定在衬底表面的大致反应过程。图3展示点样过程。图4是密封盒的截面图。图5展示预杂交过程。图6展示清洗过程。图7展示杂交过程。
实施本发明的最佳模式以下进一步阐述本发明(1)衬底制备本发明使用的衬底具有可将DNA片段、蛋白质、肽和类似物牢固固定在其表面的特征，即使衬底经过清洗也不会脱落，并且还具有在荧光灯照射下可观察到清晰的荧光点的特征，这些特征是含有以下步骤的程序的结果在如玻璃、塑料、硅等支持物表面形成处理层，接着用化学修饰的方法连接如DNA探针、蛋白质、肽等生物物质。表面处理层优选由金刚石、软金刚石(soft diamond)、碳基材料或其混合物或其薄层制造，也可用碳化物比如碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、一碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等制造。此处提到的软金刚石通常是指不完全金钢石结构，是金刚石和碳比如类金刚石碳(DLC)以任何比例混合的混合物。
此种衬底的例子是通过在玻璃载玻片上形成软金刚石薄膜而形成的衬底。
此衬底表面的处理层厚度在1nm到1000nm之间。
此衬底的类金刚石碳优选通过电离蒸气沉积法制备，所用气体混合物包括占体积1％到99％的氢气和作为平衡物的占体积99％到1％的甲烷。
在此衬底的正面和背面可涂上单层的钛、金、铂、铌、WC等或其复合薄膜作为反射层。反射层的厚度优选在100nm或更厚以确保形成完全均匀的包被膜。厚度在1000nm或更厚尤佳。
优选的是，玻璃衬底表面的粗糙程度应在Ra(JIS B 0601)1nm到1000nm之间。此粗糙化的表面由于提高了衬底的表面积而利于固定大量的探针及其类似物并可形成较高的密度。
衬底的表面处理层可通过已知的方法制造，例如，微波等离子CVD法、ECRCVD法、IPC法、直流喷射法、ECR喷射法、离子镀法、电弧离子镀法(arc ion plating method)、EB蒸气沉积法、电阻加热蒸气沉积法(resistance heating vapor deposition method)、电离蒸气沉积法、电弧蒸气沉积法、激光蒸气沉积法等。
衬底结构的形成不仅可通过在衬底表面附加处理层的方法实现，还可通过结合其他材料的方法实现，这些材料有合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、金属如金、银、铜、铝、钨等、塑料如聚碳酸酯、氟化树脂等、与作为粘合剂的树脂混合的金属粉末或陶瓷粉末。起始材料如金属粉末或陶瓷粉末可以被压模机压制并高温烧结。金刚石与其他物质(如两相物质)的复合物也可用于本方法。
衬体的形状并不特别限制，可以是板状、绳状、球形、多边形、粉末等。
对衬体表面进一步化学修饰以固定DNA或蛋白质。化学修饰的一个例子是将在烃链末端带有活性酯的基团通过酰胺键固定在支持物表面。此化学修饰促进DNA、蛋白质、肽等生物物质在衬底表面的固定。化学修饰还可以通过用末端带有极性基团的烃基取代固体支持物表面的方法实现，极性基团可以是羟基、羧基、环氧基、氨基、硫羟基、异氰酸盐(或酯)基团等。
此类烃基可有如1到12个碳原子，优选1到6个碳原子，可作例子的是以下化合物单羧酸，如甲酸、乙酸、丙酸等；双羧酸如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸等；多价羧酸如偏苯三酸等。以上所列中以草酸和琥珀酸为优选。
化学修饰还可通过以下步骤实现例如先在氯气中用紫外光照射支持物将支持物表面氯化，然后在氨气中用紫外光照射以进行氨基化，接下来用适当的酰基氯或酸酐羧化。或者可用等离子体代替氯化在氨气中氨基化衬底表面，然后用酰基氯或酸酐羧化完成化学修饰。
(2)激活试剂盒依照本发明的激活试剂盒由N-羟基琥珀酰亚胺和磷酸盐缓冲液(pH6)组成的溶液A和1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺组成的溶液B(二噁烷溶液)组成。
对硝基苯酚可代替N-羟基琥珀酰亚胺。
依照本发明的激活试剂盒，软金刚石包被的玻璃载玻片(在其表面引入羧基)可以用N-羟基琥珀酰亚胺派生成活性酯表面，得到图1所示的衬底。
从而，激活金刚石表面后，DNA碱基的伯氨基就可以酰胺键连接。
(参见图2)溶液A(水溶液)含有pH6的浓度从0.01M到5M的磷酸盐缓冲液和浓度从1mM到500mM(0.115g/L到57.5g/L)的N-羟基琥珀酰亚胺。
磷酸盐缓冲液(pH6)可用0.1M的磷酸二氢钾溶液和0.1M的磷酸氢二钾溶液制备，即在磷酸二氢钾溶液中加入磷酸氢二钾溶液并监控pH值变化，直到pH为6。
溶液B(二噁烷溶液)可通过在二噁烷中加入浓度为0.05M到10M(9.59g/L到1918g/L)的1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺制备。
在本发明激活试剂盒中，50％到99％体积百分比的溶液A与50％到1％体积百分比的溶液B按比例混合存在。
在容器比如烧杯中混合溶液A和溶液B，然后将衬底浸入混合溶液，于4℃到50℃下反应5到120分钟(优选搅伴)。在用N-羟基琥珀酰亚胺把衬底(诸如软金刚石包被的玻璃载玻片)表面的羧基转化为活性酯后，即在激活金刚石表面后，就可与DNA碱基中的伯氨基形成酰胺键(图2)。以本法激活的衬底可以用如无菌水清洗。
激活后的衬底应尽快使用，以避免活性的降低。衬底干燥后优选贮存在干燥器内。
依照本发明，使用上述激活试剂盒激活的衬底，DNA可以经过如下步骤得到检测。
(3)点样步骤在用本发明激活试剂盒激活的衬底上，DNA沉积方法如下(点样)。
首先，DNA溶液用超纯水制备，浓度为0.01μg/μL到10μg/μL。尽管SSC、TE等可用作点样缓冲液，还是用1％到50％甲酰胺溶液、1-50％甘油溶液或1-50％二甲基亚砜溶液来完成稳定点样，由于其有较高粘度并能避免蒸发。
然后点样缓冲液用点样器(spotter)点样在已激活的衬底上。此处的点样缓冲液可先热解或碱解处理，以把双链DNA转化成单链DNA，然后快速冷却。点样缓冲液由例如点样器的针头吸入(如图3a所示)，接下来将点样器针头压在衬底上(b)，点DNA溶液(c)，这样就可以将各种DNA沉积在玻璃载玻片表面(d)。
(4)温育步骤接下来，为继续点样DNA固定在衬底表面上的反应，须进行温育。由于DNA固定在衬底上的共价结合是化学反应的结果，为确保反应进行应在点样后立即开始温育。
温育优选在高湿度的条件下进行，所以可能用到例如图4的密封盒。密封盒中，由饱和氯化钠溶液提供湿室(humidity conditionedchamber)，其中的湿度保持恒定。例如，可将其置于0℃到80℃的保温箱中直到整个密封盒的温度达到0℃到80℃。优选温度控制在45℃到70℃之间。饱和氯化钠溶液可由如50％的甲酰胺水溶液代替。除氯化钠溶液外，还可用水或氯化钾溶液。
尽管保温箱的温度可以是0℃到80℃，为良好的固定反应起见，优选把温度控制在45℃到70℃之间。
当密封盒成为湿室后，放入已点样的衬底，并在恒定湿度下温育。
衬底优选不要接触饱和氯化钠溶液或50％的甲酰胺水溶液。例如可将衬底放在密封盒底部突起的部分之上(如图4所示)。
温育优选进行0.1到24小时。温育后，衬底优选置于65℃到95℃恒温室内干燥1小时或以上。
除在高湿度环境中温育的方法以外，使用胶体溶液的方法可使固定反应更稳定地进行，并能更加促进该反应。例如，作为胶体溶液的组分，吸水聚合物如琼脂糖、明胶、交联聚环氧乙烷(polyethylene oxide)等都是优选的。另外，具有封闭功能的蛋白质包括白蛋白、鲑精DNA、脱氧核糖三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphate)、Denhart氏溶液都是优选的添加剂。胶体溶液的浓度优选在0.01％到99％，更优选在0.3％到3％。
将形成的凝胶碎片置于DNA点样的位置，在0℃到80℃湿室中进行下一步反应。在此阶段，最好在放置凝胶前在40-80℃恒温室内干燥衬底，以免DNA的泄漏。
在湿室中取出衬底后，清洗衬底。首先，把衬底浸于盛清洗溶液(如2×SSC，0.2％SDS)的桶中，点样DNA的面朝上。然后，用振荡器等振荡完成清洗，替换清洗溶液，重复清洗。用稀释的清洗溶液(如0.1×SSC)漂洗后，衬底用离心机或吹风机干燥。
如果在温育步骤使用含有添加剂如蛋白质的胶体溶液，接下来的预杂交步骤可省略。
(5)预杂交步骤温育后的衬底在用于杂交前需要预先处理，即预杂交来封闭任何有害的活性点。预杂交可使用牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、鲑精DNA、Denhart氏溶液等，上述物质可以与20×SSC、SDS、甲酰胺等组合以制备溶液，该溶液可用作预杂交溶液。如果预杂交溶液中有DNA如鲑精DNA，先将其加热后快速冷却以热解双链DNA成单链DNA。
预杂交溶液可以是如含有Denhart氏溶液和甲酰胺(5×Denhart氏溶液，50％甲酰胺)的溶液。
在衬底上已点样DNA的位置滴加预杂交溶液，然后小心盖上玻璃盖玻片，避免引入任何气泡。
预杂交优选进行0.1到24小时。
优选在较高湿度下预杂交，以免预杂交溶液蒸干，可使用如(4)温育步骤所描述的温室。
当密封盒在设置到0到80℃的保温箱中变成温室后，就可按步骤(4)中的操作放入软金刚石包被的玻璃载玻片，放入时避免接触饱和氯化钠溶液或50％的甲酰胺水溶液(载玻片放在密封盒底部突起的部分之上)，然后把密封盒放回保温箱。这样操作的结果是玻璃载玻片上除点样的位置之外的其他表面部分都由与点样DNA无关的DNA覆盖。(图5)接下来，清洗衬底。例如将衬底浸入0.1×SSC溶液中，移去盖玻片。然后用无菌水配合振荡器等清洗衬底，最后用离心机或吹风机干燥。
若衬底已经经过下面的操作，此预杂交步骤可省略温育后，衬底置于30到80℃恒温室内干燥0.1到24小时，接下来在含有清洗溶液(如2×SSC，0.2％SDS)的桶中彻底清洗，然后用漂洗溶液(如0.1×SSC)漂洗后干燥，确保残留的活性酯全部水解和失活。但是，为获取可靠的杂交结果，最好还是进行预杂交，因为在下面的杂交步骤中，衬底上残留的未充分失活的活性酯会将DNA固定在除点样位置外衬底表面的其他部分。
(6)杂交步骤目标DNA样品先按荧光标记试剂盒所示方法或逆转录酶法进行荧光标记。
由此获得的荧光标记DNA样品与无菌水、20×SSC、SDS、甲酰胺等混合，搅拌后得到杂交溶液。
在此阶段，如果前面点样步骤中点样的DNA是双链形式并且点样缓冲液未经热解或碱解处理，须将衬底上的DNA热解。将完成(5)预杂交的衬底浸于热水中3到5分钟，然后冰上冷却。但如使用热解或碱解过的点样缓冲液可省略这个步骤。
将得到的杂交溶液滴加到衬底DNA点样的位置上，小心盖上玻璃盖玻片，避免引入任何气泡。
同样，杂交优选在高湿度条件下进行，杂交可使用第(4)步温育中描述的温室。
当密封盒在设置到0℃到80℃的保温箱中变成湿室后，就可按步骤(4)中所述放入衬底，放入时避免接触饱和氯化钠溶液或50％的甲酰胺水溶液(衬底放在密封盒底部突起的部分之上)，然后把密封盒放回保温箱。
此操作得到的结果是，荧光标记的DNA与已点样在衬底上的DNA杂交。(如图7所示)最后，清洗衬底。步骤如下先用0.1×SSC溶液从衬底上移去盖玻片，接下来在盛有清洗溶液(例如2×SSC，0.2％SDS)的桶中重复两次清洗衬底，再用漂洗溶液(例如0.1×SSC)漂洗衬底，最后用离心机或吹风机干燥。
(7)荧光位置检测步骤荧光检测可使用荧光图像读取扫描仪等完成，方法是用仪器读取与衬底表面上DNA杂交的荧光标记DNA上的荧光。
实施例(实施例1)以下讨论了使用软金刚石包被的玻璃载玻片衬底的操作程序。
(1)软金钢石包被的玻璃载玻片的制备首先，用离子化蒸气沉积法在25mm宽，75mm长，1mm厚的玻璃片上沉积25nm厚的DLC薄膜，所用蒸气是95％体积百分比的甲烷和5％体积百分比的氢气的气体混合物。
然后，化学修饰该玻璃载玻片的表面。
在氨气中用高压水银灯照射玻璃衬底表面10分钟以进行氨化，接下来把衬底浸入溶于N-甲基吡咯烷酮的琥珀酸酐溶液中60分钟，即可获得衬底表面具有羧基的软金刚石包被的玻璃载玻片。
在用N-羟基琥珀酰亚胺将衬底表面的羧基派生成活性酯后，以如图1所示方法在软金刚石包被的玻璃载玻片上固定DNA。
在金刚石表面的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯基团通过酰胺键与DNA碱基中的伯氨基相连(图2)。
(2)激活使用激活试剂盒进行激活。激活试剂盒中的溶液成分如下所述●溶液A(水溶液)磷酸盐缓冲液(pH6)0.1MN-羟基琥珀酰亚胺22mM(2.5g/L)●溶液B(二噁烷溶液)1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺1M(191.8g/L)接着pH6的磷酸盐缓冲液以如下所述方法制备。
首先，准备0.1M磷酸二氢钾溶液(13.6g/L)和0.1M的磷酸氢二钾溶液(17.4g/L)。然后在用pH计监控磷酸二氢钾溶液pH值的条件下，把磷酸氢二钾溶液加入磷酸二氢钾溶液中直到pH值为6。
激活后的衬底应尽快使用，以避免活性的降低。要贮存时，衬底在65℃下干燥30分钟后优选贮存在干燥器内。
取溶液A置于90ml烧杯中，加入10ml溶液B。搅拌溶液至完全混匀后，把溶液置于盘中，把软金刚石包被的玻璃载玻片浸入该溶液，室温放置30分钟(如果有搅拌器如振荡器，可用之搅拌)。然后将激活的软金刚石包被的玻璃载玻片用无菌水清洗两次。
激活后的衬底应尽快使用，以避免活性的降低。要贮存时，衬底在65℃下干燥30分钟后优选贮存在干燥器内。
另外，也可不用激活试剂盒激活衬底。这种情况下就可使用下面的操作程序。
首先激活衬底表面。准备以下材料●软金刚石包被的玻璃载玻片●1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺●N-羟基琥珀酰亚胺●磷酸二氢钾●磷酸氢二钾●无菌水首先，进行活性酯(羧基的N-羟基琥珀酰亚胺活性酯派生)的派生。
激活溶液的成分如下●N-羟基琥珀酰亚胺20mM●1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺0.1M●磷酸盐缓冲液(pH6)0.1M称取959mg 1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺和115mg N-羟基琥珀酰亚胺加到200mL烧杯中，然后加入50mL磷酸盐缓冲液(pH6)以形成溶液，下一步，放入玻璃载玻片反应，反应后清洗，清洗所用的方法与前面描述的使用激活试剂盒操作的方法类似。
(3)点样DNA沉积到激活的衬底上(称为点样)首先准备以下材料●软金刚石包被的玻璃载玻片(已激活)●DNA样品●甲酰胺●无菌水●点样器以1μg/μL的浓度在10％甲酰胺(点样缓冲液)中溶解DNA样品以制备点样溶液。热解点样溶液，95℃反应5分钟后迅速冷却到4℃。如图3所示，溶液由点样器的针头吸入(图3a)，接下来将点样器针头压在衬底上(b)，点DNA溶液(c)至衬底，这样就可以在玻璃载玻片表面上点样很多点(d)。
(4)温育准备软金刚石包被的玻璃载玻片、饱和氯化钠水溶液、密封盒、保温箱。首先将盛有饱和氯化钠水溶液(如1∶1混合的甲酰胺和水的溶液混合物)的密封盒放置在设于4℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到4℃，从而得到湿室。
当密封盒成为湿室后，将其从保温箱中取出，然后把软金刚石包被的玻璃载玻片放入密封盒，注意放入时避免接触饱和氯化钠水溶液(载玻片放在密封盒底部突起的部分之上)。接下来，把密封盒放回保温箱，静置1小时，在此期间温度得到调整以保证形成高湿度。装有软金刚石包被的玻璃载玻片的密封盒如图4所示。最后，把衬底放在设置为80℃的炉中干燥3小时。
(5)预杂交准备软金刚石包被的玻璃载玻片(经点样和温育)、玻璃盖玻片、鲑精DNA、20×SSC、1×SSC、10％SDS、甲酰胺、无菌水、1.5mL反应管、200μL eppendorf管、桶、振荡器、200mL烧杯、吹风机、饱和氯化钠水溶液、密封盒和保温箱，按以下程序操作。
首先与前面所述第(4)步温育程序相似，把盛有饱和氯化钠溶液的密封盒放置在设于37℃的保温箱内，放置约1小时，以确保整个密封盒的温度达到37℃，从而得到湿室。此外，还要准备预杂交溶液。
称取1mg鲑精DNA(与样品不同的DNA)置于反应管中，用500μL无菌水溶解。接下来，加入250μL 20×SSC、50μL 10％SDS、200μL甲酰胺。搅拌后，量取需要的量置于eppendorf管中作为预杂交溶液。
本实施例中，衬底上的点样区域是1cm×1cm时，每衬底使用15μL预杂交溶液。
接下来，预杂交溶液95℃热解5分钟，然后迅速冷却到4℃。在软金刚石包被的玻璃载玻片DNA点样位置上滴加预杂交溶液，小心盖上玻璃盖玻片避免引入任何气泡。这样就封闭了除点样鲑精DNA区域以外的玻璃载玻片表面的其他部分(见图5)。
然后，从保温箱中取出密封盒，将软金刚石包被的玻璃载玻片放入密封盒，注意放入时避免接触饱和氯化钠水溶液(衬底放在密封盒底部突起的部分之上)，接下来，把密封盒放回保温箱中，放置1小时以确保反应进行。
下一步是清洗。先从保温箱中取出软金刚石包被的玻璃载玻片，在置于200mL烧杯中的1×SSC溶液中移去盖玻片。然后把载玻片浸入盛有0.2％SDS和1×SSC溶液的桶中，表面向上，用振荡器振荡5分钟(图6)。接着弃去1×SSC和0.2％SDS，再次加入1×SSC和0.2％SDS，振荡5分钟。用1×SSC和0.2％SDS以相似方式再次清洗后，用0.1×SSC轻轻漂洗衬底，用吹风机吹干表面的溶液。
(6)杂交准备软金刚石包被的玻璃载玻片(已预杂交)、玻璃盖玻片、目标DNA、20×SSC、1×SSC、10％SDS、甲酰胺、无菌水、200μL eppendorf管、桶、振荡器、200mL烧杯、吹风机、荧光标记试剂盒、饱和氯化钠水溶液、密封盒和保温箱。
首先，将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放置在设于37℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到37℃，从而得到湿室。
接下来，荧光标记DNA样品。用荧光标记试剂盒指导的方法标记或用逆转录酶反应进行荧光标记。
下一步，将2μL 1μg/μL荧光标记的DNA样品放入反应管，再加入48μL无菌水。之后再加入25μL 20×SSC、5μL 10％SDS、20μL甲酰胺，搅拌混匀成为杂交溶液。
将杂交溶液滴加到软金刚石包被的玻璃载玻片上，小心盖上玻璃盖玻片，避免引入任何气泡。然后从保温箱中取出密封盒，把上述玻璃载玻片放入密封盒，注意放入时避免接触饱和氯化钠水溶液(玻璃载玻片放在密封盒底部突起的部分之上)，然后把密封盒放回保温箱中放置1小时。这样，荧光标记的DNA就可与事先点样在衬底上的DNA杂交(见图7)。
最后，进行清洗。从保温箱中取出衬底，在置于200mL烧杯中的1×SSC溶液中移去盖玻片。然后把衬底浸入盛有1×SSC和0.2％SDS的溶液的桶中，表面向上，用振荡器振荡5分钟。用1×SSC和0.2％SDS再次清洗后用0.1×SSC轻轻漂洗衬底，用吹风机吹干表面的溶液。
(7)检测检测是通过使用荧光图像读取扫描仪读取荧光标记实现的。读取的是与软金刚石包被的玻璃载玻片表面的DNA杂交的DNA的荧光标记形成的荧光图像。
尽管上文叙述的是有关DNA的检测，但同样可用于蛋白质的检测。
(实施例2)首先用实施例1中的类似方法激活与实施例1中所用相似的软金刚石包被的玻璃载玻片。用与实施例1中相似的溶液进行点样，所不同的是用10％甘油供替甲酰胺。
(4)温育为了温育，首先将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放置在设于4℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到4℃。然后从保温箱中取出密封盒，放入衬底，注意放入时避免接触饱和氯化钠水溶液(衬底放在底部的突出部分上)。接下来把密封盒放回保温箱内，放置1小时。再将含有饱和氯化钠水溶液的密封盒放在设为65℃的保温箱中1小时，然后干燥。干燥后用含10％SDS和20×SSC的缓冲溶液清洗。此处没有进行实施例1中的预杂交步骤。
(6)杂交准备软金刚石包被的玻璃载玻片(已经预杂交的)、玻璃盖玻片、目标DNA、20×SSC、1×SSC、10％SDS、甲酰胺、无菌水、200μLeppendorf管、桶、振荡器、200mL烧杯、吹风机、荧光标记试剂盒、饱和氯化钠水溶液、密封盒和保温箱。
首先，将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放置在设于45℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到45℃，从而得到湿室。以下操作程序与实施例1中所用类似。
检测所用方法也与实施例1类似。虽只示范了DNA的检测，但本方法也可用于蛋白质的检测。
(实施例3)首先，用实施例1中的类似方法激活与实施例1中所用相似的软金刚石包被的玻璃载玻片。用与实施例1中相似的溶液进行点样，不同处是用10％甘油代替甲酰胺。
(4)温育为了温育，首先将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放置在设于4℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到4℃。然后从保温箱中取出密封盒，放入衬底，注意放入时避免接触饱和氯化钠水溶液(衬底放在密封盒底部突起的部分之上)。接下来把密封盒放回保温箱内，放置1小时。再将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放在设为65℃的保温箱中1小时，然后干燥。将0.5％琼脂糖凝胶加到衬底表面，然后把衬底放在密封盒中，再把密封盒放置在45℃的保温箱中12小时。
使用含0.2％SDS和20×SSC的缓冲溶液清洗，然后再用0.1×SSC溶液清洗。最后的清洗使用70％乙醇溶液。此处没有进行实施例1中的预杂交步骤。
(6)杂交准备软金刚石包被的玻璃载玻片(已经预杂交的)、玻璃盖玻片、目标DNA、20×SSC、1×SSC、10％SDS、甲酰胺、无菌水、200μLeppendorf管、桶、振荡器、200mL烧杯、吹风机、荧光标记试剂盒、饱和氯化钠水溶液、密封盒和保温箱。
首先，将盛有饱和氯化钠水溶液的密封盒放置在设于45℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到45℃从而得到湿室。以下操作程序与实施例1中所用类似。
检测所用方法也与实施例1类似。虽只示范了DNA的检测，但本方法也可用于蛋白质的检测。
(实施例4)
首先用实施例1中的类似方法激活与实施例1中所用相似的软金刚石包被的玻璃载玻片。为了点样，只使用超纯水而不加实施例1中所用的甲酰胺。
(4)温育为了温育，首先将盛有50％甲酰胺水溶液的密封盒放置在设于60℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到60℃。然后取出密封盒，放入衬底，注意放入时避免接触50％甲酰胺水溶液(衬底放在密封盒底部突起的部分之上)。接下来把密封盒放回保温箱内，放置3小时。然后用含有0.2％SDS和20×SSC的缓冲溶液清洗，再用0.1×SSC清洗，之后用无菌水漂洗衬底后用吹风机吹干。将预杂交溶液(5×Denhart氏溶液，50％甲酰胺)滴加到衬底上，小心盖上玻璃盖玻片，避免引入任何气泡。然后从设为60℃保温箱中取出密封盒，把衬底放入密封盒，注意放入时避免接触50％甲酰胺。然后把密封盒放回设为60℃的保温箱中从而进行预杂交1小时。
接下来，玻璃盖玻片用0.1×SSC溶液冲去，再用无菌水清洗衬底15分钟。之后，用吹风机吹干表面溶液。
(6)杂交准备软金刚石包被的玻璃载玻片(已经预杂交的)、玻璃盖玻片、目标DNA、20×SSC、1×SSC、10％SDS、甲酰胺、无菌水、200μLeppendorf管、桶、振荡器、200mL烧杯、吹风机、荧光标记试剂盒、50％甲酰胺水溶液、密封盒和保温箱。
将盛有50％甲酰胺水溶液的密封盒放置在设于45℃的保温箱中，放置约1小时，确保整个密封盒温度达到45℃从而得到湿室。以下操作程序与实施例1中所用类似。
检测所用方法也与实施例1类似。虽只示范了DNA的检测，但本方法也可用于蛋白质的检测。
工业应用性使用本发明的激活试剂盒(包括溶液A和溶液B)可以快速、方便的将衬底激活，因为只需一步反应就可激活衬底。
根据包括预杂交的本发明检测DNA或蛋白质的方法，还可以精确检测DNA，而不会让DNA沉积到有害的活性点上。
另外，使用胶体溶液的温育步骤可以稳定和促进固定反应，有利于精确检测DNA或蛋白质。
因此，本发明可用于例如医学领域的诊断疾病和生物化学和分子生物学研究之类的多个领域。
权利要求
1.包括作为主要成分的溶液A和溶液B的衬底激活试剂盒，其中，溶液A由N-羟基琥珀酰亚胺和PH6的磷酸盐缓冲液组成，溶液B由1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺组成。
2.依照权利要求1的激活试剂盒，其中所述溶液A是浓度为0.01M到5M的磷酸盐缓冲液(PH6)和浓度为1mM到500mM(0.115g/L到57.5g/L)的N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
3.依照权利要求1或2的激活试剂盒，其中所述溶液B是浓度为0.05M到10M(9.59到1918g/L)的1-[3-(二甲氨基)丙基]3-乙基碳二亚胺的二噁烷溶液。
4.依照权利要求1到3中任一项的激活试剂盒，包含50％到99％体积百分比的所述溶液A和1％到50％体积百分比的所述溶液B。
5.依照权利要求1的衬底激活试剂盒，其中所述衬底是化学修饰具有类金刚石碳表面处理层的玻璃载玻片而得到的衬底。
6.依照权利要求1或5的衬底激活试剂盒，其中所述化学修饰的特征在于在末端提供羟基、羧基、环氧基和氨基基团。
7.依照权利要求1、5或6的衬底激活试剂盒，其中所述化学修饰的特征在于把所述衬底置于氨气中进行等离子氨基化。
8.检测DNA或蛋白质的方法，包括以下操作在将DNA或蛋白质点样到用依照权利要求1的激活试剂盒激活的衬底后，但在荧光标记DNA与所述点样DNA或蛋白质杂交以前，进行预杂交以封闭衬底表面上除点样位置以外的其他部分。
9.依照权利要求8的检测DNA或蛋白质的方法，其中所指预杂交通过将不同于点样在衬底表面的DNA或蛋白质的DNA或蛋白质固定而进行。
10.检测DNA或蛋白质的方法，包括以下步骤使用权利要求1所述激活试剂盒激活衬底的步骤，将DNA或蛋白质点样到已激活的衬底上的点样步骤，点样后衬底的干燥步骤，封闭衬底表面除点样位置以外其他部分的预杂交步骤，将荧光标记DNA杂交到点样DNA或蛋白质的杂交步骤和检测杂交位置上的荧光位置的步骤。
11.检测DNA或蛋白质的方法，包括以下步骤使用权利要求1所述激活试剂盒激活衬底的步骤，将DNA或蛋白质点样到已激活的衬底上的点样步骤，点样后衬底的温育步骤，封闭衬底表面除点样位置以外其他部分的预杂交步骤，将荧光标记DNA杂交到点样DNA或蛋白质的杂交步骤和检测杂交位置上的荧光位置的步骤。
12.依照权利要求10的检测DNA或蛋白质的方法，其中预杂交步骤是把不同于点样到衬底表面的DNA或蛋白质的DNA或蛋白质固定的步骤。
13.检测DNA或蛋白质的方法，包括以下步骤使用权利要求1所述激活试剂盒激活衬底的步骤，将DNA或蛋白质点样到已激活的衬底上的点样步骤，点样后衬底的温育步骤，将荧光标记DNA杂交到点样DNA或蛋白质的杂交步骤和检测杂交位置上的荧光位置的步骤。
14.依照权利要求11到13的DNA或蛋白质检测方法，其中的温育步骤包括使用由胶体组成的溶液的处理。
15.依照权利要求14的DNA或蛋白质检测方法，其中所述由胶体组成的溶液含有吸水聚合物。
16.依照权利要求15的DNA或蛋白质检测方法，其中所述吸水聚合物是琼脂糖、明胶或交联的聚环氧乙烷。
17.依照权利要求14到16的DNA或蛋白质的检测方法，其中所述由胶体组成的溶液含有蛋白质、鲑精DNA、脱氧核苷三磷酸和Denhart氏溶液。
全文摘要
本发明目的在于提供一种方便、快速的将DNA固定在衬底上的方法和精确检测DNA的方法，并且应用本方法固定DNA的密度与传统方法同样高。提供了底物激活试剂盒，其包括pH6的磷酸盐缓冲液，N－羟基琥珀酰亚胺的溶液A(水溶液)和1－[3－(二甲氨基)丙基]3－乙基碳二亚胺的溶液B(二噁烷溶液)；提供了检测DNA的方法，特征在于将DNA点样到用上述激活试剂盒激活的衬底上，然后用荧光标记的DNA与点样DNA杂交。
文档编号G01N33/552GK1606693SQ0181479
公开日2005年4月13日 申请日期2001年6月20日 优先权日2000年8月8日
发明者冈村浩, 丹花通文, 山川薰, 大场光芳, 高木研一 申请人:东洋钢钣株式会社