专利名称：制备探针分子的平面检测阵列的多个相同副本的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备探针分子的平面检测阵列的多个相同副本的方法，其是基于被切成所期望长度的纤维束，而所述探针分子是用于检测目标分子。
背景技术：
以组织有序的方式沉积/结合/固定在平面表面上的大量不同探针或探针分子或测试化合物的集合在科技术语中被称为阵列。此等阵列通过分析探针/探针分子/测试化合物与例如生物样品中的分析物或者分析物的混合物(即、目标生物分子)之间的相互反应而能够同时快速检测/分析所有的探针/探针分子/检测化合物。相比于在流动单元如珠(beads)上使用固定化探针、探针分子或测试化合物的同时检测/分析法，阵列的优点在于，在阵列中，所固定的探针、探针分子或者测试分子的类型(化学结构和/或个体性质)通过在阵列表面上的位置而可精确知晓，并且局部检测信号(这通过与目标分子的相互作用例如结合而产生，或者例如由于目标分子对探针的酶解转化作用而消失，而且由此可间接用于检测)因此可立即鉴定分子的类型。特别是在微小化的形式时，包含有生物探针、探针分子或测试分子的阵列也被称为生物芯片。
所述阵列的重要例子有DNA片段、cDNA、RNA、PCR产物、质粒、噬菌体、合成的寡核苷酸或者通过与互补核酸分析物的杂交(形成双链分子)来读取的合成PNA寡聚物的核酸阵列；
抗体、在细胞中表达的蛋白质、噬菌体融合蛋白的蛋白质阵列；以及合成肽、其类似物如类肽(peptoid)、寡聚氨酯等、或者通常例如通过与亲和性蛋白分析物或者其他分析物的结合或者例如通过酶解转化作用来读取的有机化合物的化合物阵列。
这些阵列以及用于研制这些阵列的方法和装置都用于基础生物学研究中，特别是用于医疗诊断以及药物的研制中。自然科学中其他领域的研究，例如催化剂的研制以及材料科学，也开始成功地采用此等概念。有利地常规使用这些阵列的一个前提条件是廉价、快速以及完全自动化，以及测试结构(信息含量)的高密度和多样性。
此等阵列通常是根据两种不同的原理通过将探针、探针分子或测试分子沉积在已预先制备好的材料表面上而制备的(在以下文献中提供了最新的综述S.Woelfl，transcript Laborwelt 2000，3，12-20)。
(a)将预制探针、探针分子或测试化合物的溶液单个地分布在所述表面上；(b)在所述表面上重复、系列化地分布用于原位化学合成探针、探针分子或测试化合物的构建块溶液。
预先已知的芯片构型可利用阵列单元的长方形x/y设置，该设置是通过相应的x/y移液工位或者通过相应制造的光能无机描示(photolitho-graphic)或打印掩膜进行计量加入而制得的；或者是圆形的rφ设置，该设置是通过旋转移动芯片表面(rφ阵列)以及一个用于定时快速操作的计量装置而制得的。因此，有可能得到每立方厘米高至1百万个探针、探针分子或测试化合物的密度或者每单个面积为几个平方微米的密度。
但是在用于常规医疗诊断中时，对于非常大量(几百万)的测试非常严格地要求分析结果具有重复性。这要求每一个生产批次、以及不同生产批次的芯片(阵列)具有几乎相同的性质。然而，所有的上述生产方法都具有一个最大的缺陷，即、如此制得的每个阵列仅能够在非常有限的程度上可以与第二个“相同”制备的阵列相比，这是因为每个阵列单元都是在单个过程中制得的。
还有一个事实是，探针、探针分子或化合物的相同溶液分布在一系列不同阵列的相同位置上。由于计量的不精确性、表面特征的不均匀性以及固定或合成步骤中的官能团及不同反应产率，都会发生误差或者偏差。
阵列单元的空间尺寸越小，此等误差的变化就越大，而且如果制备每个单独阵列单元需要多个步骤，则呈指数变大。
由于阵列单元中各种探针、探针分子或测试化合物的化学结构和性质不同，参比装置也仅是相对性地能够校正上述偏差。每个单独阵列的质量测试不是一个好的选择，因为这将太过昂贵，而且许多测试不能可逆地进行，也就是说阵列将由于质量控制而被不可逆地改变。
Fislage和Teterin已经在DE 198 03 077 C1中描述了一种“制备用于特异性检测受体物质-配体物质复合物的单个反应物的结构测试体的方法”，其中结合有反应物的材料层堆积并粘结在一起以形成一个三维体，而且该三维体随后用切片机以与所述层的平面呈一定角度地切成薄的层。如此制得的层由相互靠紧的薄条组成，每个条包含不同的反应物质，使得在生物测试中可在一个测试体中平行且同时地检测几种不同的反应物。因此，他们提出了一种切削细薄片的方法，该薄片是从由携带不同物质的片段组成的物体中切得的。但是，由该方法制得的条状测试体仅使用一维来设置用于平行测试的多种反应物。这些在DE 198 03 077中描述的反应物也可被理解为探针分子。
Anderson、Anderson和Braatz(WO 01/09607 A1)已通过以下方法克服了上述缺陷首先在线段上负载各种反应物，然后平行地并排放置成长方形栅网形，然后由所述线段切割三维体。该制备方法肯定可以用于较厚的纤维，如那些在实施例中描述的纤维。但是，如果纤维的厚度处于微米范围内，并且将数十万根纤维平行设置，那么必须设计出高精确度的机器。
发明内容
因此，本发明的目的是克服与以上现有技术相关的缺陷或问题。
本发明由此涉及一种用于制备探针分子的平面测试阵列的多个相同副本的方法，所述探针分子是用于检测目标分子，其中，(a)使用大量纤维作为起始点，其中每个纤维仅具有一个类型的用于检测一个类型的目标分子的探针分子，而且纤维的数量至少相应于不同类型的待检测的目标分子的数量，(b)将所述大量的纤维按照平行方向设置，(c)将如上设置的纤维成束以形成纤维束，并成为最紧密的堆积(从垂直于纤维截面的角度观察)，(d)单个纤维相互之间在纤维束中的设置是不可变更地固定，使得每个纤维占据一个几何限定位置，并得到固化的纤维束，以及(e)以所希望的间隔按照垂直于纤维长度的方向切割所述经固化的纤维束，产生平面检测阵列的多个相同副本，该阵列具有用于检测目标分子的探针分子，该探针分子在切割表面上处于几何限定的位置中。
根据本发明，WO 01/09607的现有技术在以下方法得到改进将纤维相互靠紧放置的过程现在变为一个简单并且自我组织的过程。纤维首先被大约相互平行且有间隔地设置，并由此能够以所希望的顺序放置或者仅在它们设置期间一层一层地负载探针分子。该设置过程不需要高的精确度，而仅是必须确保正确的设置。
从属权利要求涉及本发明的其他有利和/或优选实施方案。
根据一个实施方案，本发明涉及一种将大量的探针分子固定在大量纤维的相应表面上或者在这些表面上合成所述大量探针分子的方法。
根据另一个实施方案，本发明涉及一种通过挤出大量基础纤维材料制备大量纤维的方法，每种基础纤维材料在其上固定有大量探针分子。
根据本发明的一个实施方案，所述纤维例如由多孔合成材料、特别是聚酯、聚氨酯或者尼龙、纤维素、乙酸纤维素、棉花或者丝绸组成。但是，纤维不一定必须为多孔性的。还可使用例如由玻璃、金属、金属氧化物或者半金属氧化物组成的纤维。但是在检测过程中，仅在纤维上的“涂层”区域中形成信号，也就是说一种环绕纤维的环状信号，但该信号不一定有在纤维的整个截面上延伸的信号那么强。
如果其上固定有探针分子的基础纤维材料被用于挤出，则本领域技术人员可按照与官能化基础纤维材料的温和挤出有关的现有技术来实施，例如参见Science，295(2002)472，以及Schnegelsberg，Handbuch derFaser，Theorie und Systematik der Faser(纤维手册，纤维的理论和系统)，1999，ISBN 3 871 506 249。
根据本发明的又一个实施方案，形成纤维束的纤维组合是例如通过在相同方向上扭转或者相互缠绕来实现的。
纤维束的扭转自动地使纤维尽可能地相互靠紧。这产生了与最紧密压紧原理略有不同的纤维设置，但是纤维之间的相互空间位置并没有由此而改变。另一个优点是测试阵列更为致密。
根据本发明再一个实施方案，纤维相互之间不可改变的固定设置以及纤维束的固化例如是通过以下方法实现的在可固化材料中嵌入或者聚合，随后进行硬化或完全聚合或冷冻。
根据本发明的另一个实施方案，可固化的材料例如是石蜡、明胶、聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG水溶液。原则上，任何适用于组织切片或者冷冻切片的材料都是合适的。本领域技术人员对于可固化材料与纤维的硬度之间的匹配性是熟知的。
根据本发明的再一个实施方案，已固化的纤维束例如用切片机(例如超声切片机)或者冷冻切片机进行切割；该切割是垂直于纤维束的轴或者与纤维束的轴呈一定角度地实施。
本发明还涉及用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列，该测试阵列是通过在一个并且相同的平面上最致密地二维设置或者最紧密压紧具有表面积、特别是相同表面积的平面单元而形成的，其中每个单元仅具有一个类型的用于检测一个类型目标分子的探针分子，而且纤维的数量至少相应于待检测的目标分子的不同类型数目。
本发明进一步涉及通过本发明的方法制得的用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列。
在根据本发明的平面测试阵列中，目标分子可以是目标生物分子。
在根据本发明的平面测试阵列中，具有相同表面积的单元可具有盘状，特别是圆盘形状、椭圆盘状或者六边形盘状，而且可以最紧密压紧、特别是六边形最紧密压紧(由垂直于所述盘平面的角度观察)的方式存在于一个并且相同的平面中。
本发明还涉及包括一个或者多个、相同或者不同的根据本发明用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列的医疗或诊断装置。
本发明进一步涉及包括多个相同或者不同的根据本发明用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列的试剂盒。
本发明还涉及包括一个或者多个、相同或者不同的根据本发明用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列以及一种或者多种用于检测与探针分子结合的目标分子的试剂的试剂盒。
本发明还提供根据本发明的平面测试阵列、根据本发明的医疗或者诊断装置或者根据本发明的试剂盒在检测目标分子中的应用。
根据本发明所用的探针分子可以例如分别是互补结合配偶体之特异性相互反应体系中的一个配偶体。
由于互补结合配偶体的结合，例如直接作为结合本身的结果或者间接地因为其他标记分子特异性地与探针/目标生物分子结合物结合(夹心分析法)，能够产生可检测的信号。结合之前存在的信号也可例如因为连接在探针上的标记物被除去或者以其他方式失活(例如当目标分子是酶时)而消失。
互补结合配偶体的特异性相互作用体系可例如依赖于核酸/互补核酸、肽核酸/核酸、酶/底物、受体/效应器、凝集素/糖、抗体/抗原、抗生物素/生物素、链霉抗生物素蛋白/生物素的相互作用。
上述抗体可以例如是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或者单链抗体或者此等抗体的功能片段或衍生物。
以下将借助于示意性的实施方案以及参考附图对本发明进行更为详细的说明，但这绝不是对本发明范围的限制。
图1A是根据本发明的方法的一个实施方案的每个步骤的示意图，而且也是根据本发明方法得到的产品的一个实施方案的示意图。
图1B是根据本发明的方法的一个实施方案的每个步骤的另一个示意图。
图2和2A至2C是本发明的一个实施方案的每个步骤的其他示意图。
图3显示了根据本发明致密的纤维束以及通过该纤维束得到的测试阵列。
图4是根据本发明致密的纤维束或者根据本发明的测试阵列的前示图。
具体实施例方式
如图1所示，在其上固定有大量探针分子的基础纤维材料可用作起始点，而且该材料可通过喷嘴束或者喷嘴组纺成大约相互平行的纤维，这些纤维固定在与喷嘴相对设置的板或者多孔板上。为简单起见，仅显示了一个喷嘴。另外，已纺的线可由多孔板中穿过。
图1A中示出的板是长方形或者正方形的，并且设有按照正方形格栅构型设置的孔，图1B中示出的板大约呈圆形，孔的设置大致为六边形。
图2是用于平行设置纤维的装置的平面图，而图2A至2C是其截面图。该装置设有导销2，其用于以曲折的方式定位连续的线(在1处开始并在8处结束)。如图1B所示，所述装置中大致呈长方形的基底设有通道样的沟7、通道或者槽，它们用于接纳所述线的单独平行部分。在这些沟7中，纤维可进行浸渍或者官能化。塑料条5用于支持和/或覆盖平行部分的末端部分，并且可焊接和/或粘结在所述末端部分上。多对塑料条5与按照曲折方式焊接或粘结于其上的线可借助于钉子相互堆叠在一起，所述钉子是通过设在塑料条5中的导孔6而被导入的。
图3显示了经过扭转的纤维束，由该纤维束通过使用切片机刀刃可切割根据本发明的测试阵列。这些测试阵列设有4个标记，使得它们能够按照类似的方式取向。
图4显示了相互组合在一起并具有不同截面的纤维的测试阵列。
根据本发明，在制备用于常规医疗诊断的阵列时，特别推荐以下方法，其中由相同的材料制造大量相同阵列的每个阵列单元首先，例如将探针或者探针分子固定在“一维”线、丝或棒单元(“1D单元”)上。这可例如通过将合适的探针分子直接或者通过合适的连接物结合在“1D单元”表面上的活性基团上。例如，探针分子的溶液可向下流过垂直固定的线，或者所述线由探针分子的溶液浴中拖过或者放置在该溶液浴中。对于具体的方法没有限制。优选的是，所述线例如用探针分子的溶液饱和/浸渍。如果是多孔纤维，例如纤维素或者棉线，该饱和/浸渍过程由于灯芯作用(吸附)可自动进行，而且使探针分子的溶液均匀地分布在所述纤维中。
“一维”线、丝或棒单元(“1D单元”)可沿长度方向平行放置，然后按照与制造绳子相同的方式通过最佳紧密压紧(例如缠绕)牢固地相互组合在一起，以形成“三维”阵列体(“3D体”)。这可最简单地例如通过沿相同的方向扭转纤维或者其他类型的缠绕方法来实现。3D体接着用固化材料浸渍，该固化材料本身没有任何限制。接着，在3D体的一端，垂直于所组合的“一维”阵列单元的轴或者与该轴成一定角度地进行切割。切割表面相应于常规阵列中阵列单元的二维设置(2D阵列)。可一个接一个地切割下大量的薄切片，而且每个切片由相同的2D阵列组成。这些阵列可放置在稳定的支持体上，并且可按照与其他常规阵列相同的方式进行进一步的处理。
该新的制造方法具有以下有利的特征(a)“1D单元”可由预制的材料(棒、丝、或线)组成，每个单元在一个预先完成的步骤中负载一个探针、探针分子或化合物。所述负载是一个如下的过程探针、探针分子或化合物固定在表面上，或者根据固相合成原理在所述表面上原位进行化学合成。简单的例子是纤维素、乙酸纤维素或棉线，而化合物被化学性地连接在这些物质的羟基官能团上。在丝线或者合成材料的线上，特别是聚酯、聚氨酯或尼龙基的线，可使用类似的方法。在以下书籍中可发现许多用于将分子固定在表面上的例子，而所述分子适用于探针/目标生物分子的组合或者通常用于生物结合系统G.T.Hermanson的“生物结合技术(Bioconjugate Techniques)”，Academic Press，1996。在以下书籍中则可发现许多用于固相合成的系统的例子F.Z.Doerwald的“固相有机合成(Organic Synthesis on SolidPhase)”，Wiley-VCH，2000。
或者，“1D单元”也可直接例如由合适的基础材料的溶液制备，在此情况下，探针、探针分子或者测试化合物已共价键地、离子性地或者机械地结合在所述基础材料的分子上；例如参考WO 99/54729。该制备过程可象制备合成纤维或者粘性乙酸纤维素或丝绸纤维那样，例如通过挤出法实施。在此情况下，通过挤出喷嘴的相应孔，还可得到长方形、六边形或者其他形状的纤维/丝。
该方法确保每个阵列单元(其在后来以非常小的部分得到)由在预先的制备方法中制造的相同材料组成。
(b)在本发明的一个实施方案中，“1D单元”的设置及组合可类似于制造绳子的过程。纤维的末端按照所希望的阵列顺序设置，同时相互隔开，然后略微扭转这些线。扭转后形成牢固组合在一起并且致密的束。该致密作用是自我组织的，而且是可重现的。在精确测定2D阵列部分的最终取向时，可插入例如具有显色、荧光或者其他合适标记的参比纤维。对于多个系列的所有阵列仅需要一个分类操作。
(c)切割操作相应于常规的切片法，用该方法可制造出极薄的嵌入在合适介质中的生物材料切片。超薄切片机可产生小至仅0.1微米厚的切片。因此，由1米长的3D体中可以没有任何困难地制备出一千万个厚度为0.1μm的阵列切片。
为此目的，3D体用适用于切片的材料(石蜡、明胶、聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG的水溶液)浸渍，然后象生物材料那样在其中嵌入或者聚合或者冷冻纤维。在此方面，适合于本发明的切片机和超薄切片机的制造商有许多标示。
(d)切片机切下的切片可放置在稳定的支持体如玻璃上，结合，然后如果需要，象常规阵列使用时作进一步的处理。阵列支持体的尺寸可与常规阵列的尺寸相匹配(例如，显微镜载玻片的尺寸为2.5×7.5cm)，使得仍可以使用用于测试和读取阵列的市售装置。
在一个支持体上可放置一个切片，也可在同一个支持体上放置多个切片(“阵列的阵列”)。在后一种情况下，可设置多个相同的阵列，或者也可设置多个不同的阵列。在此等“阵列的阵列”上的切片之间，可放置或者制造小的网，以得到分开的室，而且每个单独的切片可同时用不同的生物样品进行检测。
整个方法都可容易地完全自动化。
标号说明A用于引导纤维的右端片B用于浸渍通道的中心片C用于引导纤维的左端片1线(开始)2导销3用于填充浸渍通道7的移液管4用于切割纤维平面的线5用于焊接纤维末端的塑料条6用于堆叠纤维平面的导孔7用于浸渍溶液的通道8线(末端)
权利要求
1.一种用于制备探针分子的平面测试阵列的多个相同副本的方法，所述探针分子是用于检测目标分子，其中，(a)使用大量纤维作为起始点，其中每个纤维仅具有一个类型的用于检测一个类型目标分子的探针分子，而且纤维的数量至少相应于不同类型的待检测的目标分子的数量，(b)将所述大量的纤维按照平行方向设置，(c)使单独的纤维成束以形成纤维束，并成为最紧密的堆积(从垂直于纤维截面的角度观察)，(d)单个纤维相互之间在纤维束中的设置是不可变更地固定，使得每个纤维占据一个几何限定位置，并得到固化的纤维束，以及(e)以所纤维的间隔按照垂直于纤维长度的方向切割所述经固化的纤维束，产生平面检测阵列的多个相同副本，该阵列具有用于检测目标分子的探针分子，该探针分子在切割表面上处于几何限定的位置中。
2.如权利要求1所述的方法，其中单独的纤维成束以形成纤维束(亚纤维束)，然后使多个所述纤维束成束以形成组合纤维束(超纤维束)。
3.如权利要求1和/或2所述的方法，其中在步骤(a)和(b)中，(i)由喷嘴束中纺出大量的纤维，或者(ii)一个连续的纤维以曲折的方式设置在多个平面中，并且可由曲折中的平行部分形成大量纤维，或者(iii)多个连续的纤维以曲折的方式分别设置在平行平面中的一个平面上，然后由曲折中的平行部分形成大量纤维。
4.如至少一个前述权利要求所述的方法，其中大量探针分子分别固定在大量纤维的相应表面上或者在这些表面上进行合成，而且每个表面由可达到的内表面和外表面形成。
5.如权利要求1-3中至少一个所述的方法，其中大量的纤维是通过挤出大量的基础纤维材料而制得的，每个所述基础纤维材料在其上固定有大量的探针分子。
6.如至少一个前述权利要求所述的方法，其中纤维由多孔合成材料组成，特别是聚酯、聚氨酯或尼龙、纤维素、乙酸纤维素、棉花或丝绸，特别是天然丝绸。
7.如至少一个前述权利要求所述的方法，其中形成纤维束的纤维组合是通过沿相同方向扭转或者缠绕来实施的。
8.如至少一个前述权利要求所述的方法，其中纤维相互之间不可改变的固定设置以及纤维束的固化是通过以下方法实施的在可固化材料中嵌入或者聚合，然后进行硬化、完全聚合或者冷冻。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述可固化的材料是石蜡、明胶、聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇水溶液或者聚乙烯醇/PEG水溶液。
10.如至少一个前述权利要求所述的方法，其中已固化的纤维束用切片机或者冷冻切片机进行切割。
11.用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列，其中该测试阵列是通过在一个并且相同的平面上最致密地二维设置或者最紧密压紧具有表面积、特别是相同表面积的平面单元而形成的。
12.如权利要求11所述的用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列，其中每个单元仅具有一个类型的用于检测一个类型目标分子的探针分子，而且纤维的数量至少相应于待检测的目标分子的不同类型的数目。
13.如权利要求11或12所述的用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列，其中具有相同表面积的单元可具有盘状，特别是圆盘形状、椭圆盘状或者六边形盘状，而且可以最紧密压紧、特别是六边形最紧密压紧(由垂直于所述盘平面的角度观察)的方式存在于一个并且相同的平面中。
14.通过根据权利要求1-10中至少一个所述的方法制得的用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列。
15.如权利要求10-14中至少一个所述的用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列，其中目标分子是目标生物分子，特别是细胞、病毒、噬菌体、核酸、肽核酸、蛋白质、酶、受体、凝集素、糖、抗体、抗原、抗生物素、链霉抗生物素蛋白或生物素。
16.一种医疗或诊断装置，其包括一个或者多个、相同或者不同的根据权利要求10-15中至少一个用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列。
17.如权利要求17所述的装置，其是夹持、洗涤或者温育测试阵列的装置。
18.一种试剂盒，其包括多个相同或者不同的根据权利要求10-15中至少一个用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列。
19.一种试剂盒，其包括一个或者多个、相同或者不同的根据权利要求10-15中至少一个用于检测目标分子的探针分子平面测试阵列以及一种或者多种用于检测与探针分子结合的目标分子的试剂。
20.根据权利要求10-15中至少一个的平面测试阵列、根据权利要求16或17的医疗或者诊断装置、或者根据权利要求18或19的试剂盒在检测目标分子、特别是目标生物分子中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于制备探针分子的平面检测阵列的多个相同副本的方法，其是基于被切成所期望长度的纤维束，而所述探针分子是用于检测目标分子。
文档编号G01N37/00GK1538873SQ02811317
公开日2004年10月20日 申请日期2002年4月5日 优先权日2001年4月5日
发明者罗纳德·弗朗克, 罗纳德 弗朗克 申请人:生物技术研究有限公司(Gbf)