专利名称：一种检测禽流感病毒自然感染的试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测禽流感病毒自然感染的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
由于禽流感对我国的养鸡业已造成了很大的损失，因而在我国许多养鸡场不得不使用禽流感灭活疫苗，但灭活疫苗的使用增加了禽流感的监测难度，可以造成许多假阳性；而按照世界卫生组织和国家要求，必须对禽流感进行定期普查和监测。因此，建立一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊断方法是一个亟待解决的问题。
流感病毒的基因组为单股负链RNA，含有大小不同的8个独立的RNA片段，其第8片段为非结构蛋白基因，编码非结构蛋白NS1和NS2。NS1蛋白存在于病毒感染的细胞中，但在毒粒中却检测不到NS1蛋白。在细胞感染的早期，可发现细胞核内有大量的NS1蛋白存在，在感染的晚期，NS1蛋白可以在细胞浆中出现。NS1蛋白可刺激机体产生非结构蛋白抗体。研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记。
发明创造内容本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒自然感染的试剂盒。
本发明所提供的检测禽流感病毒自然感染的试剂盒，包括包被在酶标板上的禽流感病毒非结构蛋白NS1、禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清和酶标二抗。
其中，所述禽流感病毒非结构蛋白NS1是以序列表中SEQ ID No1和SEQ工D No2为引物进行PCR扩增得到的；所述禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清可为鸡源、兔源、鼠源、羊源、马源等常用免疫动物的抗血清，优选为鸡源抗血清；所述标记酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上；所述二抗可为抗鸡或抗鼠抗抗体，优选为兔抗鸡IgG。
序列表中SEQ ID No1由23个碱基组成，序列为5′-ACA GAA TTC TAA TGGATT CCA AC-3′；SEQ ID No2由23个碱基组成，序列为5′-TTA CTC GAG CTG AAACTA GAA AG-3′，扩增片段长度为850bp。
为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括阴性血清对照、血清稀释液、洗涤剂、终止剂、显色剂。
所述阴性血清对照为未感染禽流感病毒的SPF鸡血清；所述血清稀释液为BSAT(含有BSA的PBST缓冲液)；所述洗涤剂为含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液；所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺；所述终止剂为1-2mol/L硫酸或盐酸。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述检测禽流感病毒自然感染的试剂盒的方法。
本发明的制备上述检测禽流感病毒自然感染的试剂盒的方法，包括以下步骤1)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1，并包被于酶标板上，用封闭液封闭；2)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清；3)将步骤1)中得到的酶标板、步骤2)中得到的抗血清与酶标二抗共同包装，得到检测自然禽流感病毒感染的试剂盒。
在实际应用中，为了更方便现场操作，可将阴性血清对照、血清稀释液、洗涤剂、终止剂、显色剂也包装入上述试剂盒。
本发明巧妙地利用禽流感病毒非结构蛋白NS1制备了检测禽流感病毒自然感染的试剂盒，该试剂盒能特异灵敏地检测出禽流感病毒感染抗体，疫苗免疫抗体检测不出；而且制备容易，操作简单，使用方便，敏感性高，特异性强，反应快速，稳定，不但可用于实验室的诊断与科研，而且可用于大规模的流行病学调查，具有良好的应用前景。
图1为检测禽流感病毒自然感染的试剂盒结构示意图具体实施方式
实施例1、抗原-禽流感病毒非结构蛋白NS1的制备(1)禽流感病毒非结构蛋白NS1基因的扩增、克隆、测序用酚-氯仿、乙醇沉淀方法自流感病毒感染尿囊液中提取RNA，反转录之后按常规法进行PCR扩增。上游引物SEQ ID No15′-ACA GAA TTC TAA TGG ATT CCA AC-3′，含有EcoR I限制性酶切位点；下游引物SEQ ID No25′-TTA CTC GAG CTG AAA CTA-GAA AG-3′，含有Xho I限制性酶切位点。扩增片段长度为850bp。扩增程序为96℃预变性30s，96℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经QIAquick PCR purification Kit纯化后，克隆到pGEM-T Vector中，得到重组质粒pT/NS1。用EcoR I和Xho I双酶切质粒pT/NS1和表达质粒载体pET-30(c)，并从凝胶中回收NS1片段和载体片段，然后用T4连接酶做连接反应，连接产物转化于BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中得重组表达质粒pET/NS1。
以纯化质粒pET/NS1为模板，以T7 promoter primer和T7 terminator primer为测序引物，用CEQ Dye Terminal Cycle Sequence Quick Start kit试剂盒进行测序反应，用CEQ 2000Backman Coulter Sequencer(Backman Coulter)全自动测序仪测序，序列测定结果证明插入片段与载体的连接部位的可读框正确。
(2)禽流感病毒非结构蛋白NS1基因的蛋白表达、验证、纯化及大量制备选择克隆阳性菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600≈0.5，加IPTG至终浓度为0.4mmol/L，继续培养2.5h，之后置冰中5min，5000r/min离心5min，取沉淀按常规法进行12％SDS-PAGE电泳，结果表明，含pET/NS1重组质粒的BL21(DE3)大肠杆菌经0.4mmol/L IPTG诱导后有预期的蛋白表达，其分子量约为30kDa。阳性者，留种保存，并进行Western-blot验证，结果表明，IPTG诱导样本有特异条带，而未加IPTG诱导的大肠杆菌未见特异条带，证明该30kDa蛋白带系NS1基因表达产物。
经鉴定表达蛋白正确的菌株留种保存备用，并接种LB培养基，以IPTG为诱导剂，大规模培养重组工程菌，培养物经离心后，用蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白，经计算，纯化蛋白的浓度为1.2mg/ml。
实施例2、阳性血清对照和阴性血清对照的制备(1)禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清的制备选择6～8周龄的健康SPF鸡，经HI和ELISA检测合格后，用表达纯化的非结构蛋白NS1免疫四次后。用琼脂扩散试验检测制备血清的效价，合格者，鸡只进行心脏采血。分离鸡血清，-20冰箱冷冻备用。
(2)阴性血清的制备选择6～8周龄的健康SPF鸡，经HI和ELISA检测合格后，进行心脏采集血，血液凝固后，置4冰箱过夜，行无菌操作技术，分离鸡血清，-20冰箱冷冻备用。
实施例3、酶标板的制备用包被缓冲液将稀释成0.1-1μg/ml的实施例1中纯化的NS1，聚苯乙烯微量反应板每孔加入100μl，37℃包被2h，4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200μl封闭液，37℃温育1-2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。
实施例4、试剂盒的结构(1)试剂盒的结构该试剂盒的结构如图1所示，它包括一个盒体10，其中，盒体10内带有阳性血清1、阴性血清2、酶标二抗3、底物显色液A液4、底物显色液B液5、终止液6；血清稀释液7；浓缩洗涤液8；泡沫托架9；和用铝塑膜袋封装的包被板11，以上各种液体分别装在小瓶内。
(2)试剂配制1.包被缓冲液pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液。
2.封闭液含0.5-1.5％牛血清白蛋白，0.1％-0.5％Tween-20的磷酸盐缓冲液。
3.阳性血清禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清，1-2ml/瓶，1瓶。
4.阴性血清禽流感病毒非结构蛋白NS1的阴性血清，1-2ml/瓶，1瓶。
5.酶标二抗酶标记兔抗鸡的抗抗体稀释液，5-10ml/瓶，1瓶。
6.底物显色液A液过氧化氢或过氧化脲，5-10ml，1瓶。
7.底物显色液B液 邻苯二胺(OPD)或四甲基联苯胺(TMB)，5-10ml/瓶，1瓶。
8.终止液1mol/L硫酸或盐酸，8-10ml/瓶，1瓶。
9.血清稀释液含0.5％-1.5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，30～50ml/瓶，1瓶。
10.浓缩洗涤液含0.8％-1.2％吐温的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.4)，为正常使用浓度的15～25倍，30～50ml/瓶，1瓶。含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液。
实施例5、阴阳性临界值的确定测定30份经IDEXX公司禽流感抗体检测结果为阳性而经临床调查没有经过流感疫苗免疫过的血清以及20份SPF鸡经禽流感病毒弱毒静脉接种而分离的血清，计算其OD值及标准差。阴阳性临界值＝阴性样本OD平均值+3X标准差。经计算，把阴阳性临界值定为0.16。OD值大于0.16可判定禽流感NS1抗体阳性，否则判为阴性。
实施例6、用本发明试剂盒检测禽流感自然感染鸡和疫苗免疫鸡1、禽流感自然感染鸡和疫苗免疫鸡血清样品的采集在实验室条件下，在隔离条件下，对20只SPF鸡进行禽流感病毒弱毒静脉接种，10天后翅静脉采集血清，100倍稀释后，进行ELISA检测。另一组10只鸡进行禽流感油乳剂灭活苗肌肉接种，15天后，翅静脉采集血清，100倍稀释后，进行检测。
2、检测方法(1)加入阳性血清对照、阴性血清对照向图1两个孔中分别加入实施例3制备的阳性血清对照、阴性血清对照，每孔100微升。
(2)加样品将待检血清用实施例5中的血清稀释液按1∶100的比例稀释后，加入包被板11的孔中(100微升)，37℃反应30分钟。
(3)洗涤弃掉样品，向每孔加入洗涤液(含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)200微升，洗涤3次。
(4)加酶标二抗每孔加入实施例4中制备的酶标二抗100微升，37℃反应30分钟。
(5)洗涤弃掉酶标二抗，向每孔加入洗涤液(含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液)200微升，洗涤3次。
(6)加底物弃掉以上洗涤液后，每孔加入实施例5中的底物显色液A液50μl，再加底物显色液B液50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色15-30分钟。每孔加入1mol/L硫酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪，测定每孔吸光度值(OD450值)。
(7)读数酶标仪选择450nm波长读数，OD450值大于0.16的为阳性。
结果表明禽流感实验感染鸡的OD450值平均值为0.28，禽流感疫苗免疫鸡的OD450平均值为0.07。
权利要求
1.一种检测自然禽流感病毒感染的试剂盒，包括包被在酶标板上的禽流感病毒非结构蛋白NS1和禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述检测自然禽流感病毒感染的试剂盒还包括阴性血清对照、酶标二抗、血清稀释液、浓缩洗涤剂、显色剂、终止剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述禽流感病毒非结构蛋白NS1是以序列表中SEQ ID №1和SEQ ID №2为引物进行PCR扩增得到的。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清为鸡源、兔源、鼠源、羊源或马源抗血清。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述二抗为兔抗鸡抗抗体。
7.一种制备权利要求1所述检测自然禽流感病毒感染的试剂盒的方法，包括以下步骤1)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1，并包被于酶标板上，用封闭液封闭；2)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清；3)将步骤1)中得到的酶标板、步骤2)中得到的抗血清共同包装，得到检测禽流感病毒自然感染的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述试剂盒中还包括将阴性血清对照、酶标二抗、血清稀释液、浓缩洗涤剂、终止剂和显色剂。
全文摘要
本发明公开了一种检测自然禽流感病毒感染的试剂盒及其制备方法。本发明所提供的检测自然禽流感病毒感染的试剂盒，包括包被在酶标板上的禽流感病毒非结构蛋白NS1、禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清和酶标二抗。制备上述检测自然禽流感病毒感染的试剂盒的方法，包括以下步骤1)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1，并包被于酶标板上，用封闭液封闭；2)制备禽流感病毒非结构蛋白NS1的抗血清；3)将步骤1)中得到的酶标板、步骤2)中得到的抗血清与酶标二抗共同包装，得到检测自然禽流感病毒感染的试剂盒。本发明的试剂盒能特异灵敏地检测出禽流感病毒感染抗体，疫苗免疫抗体检测不出，具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/535GK1627075SQ20031011706
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月8日 优先权日2003年12月8日
发明者刘金华, 吴清民, 樊玉磊, 魏卉玲, 刘祥 申请人:中国农业大学