专利名称：一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫磁性材料，特别是涉及一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用。
背景技术：
在人类历史上，传染病曾是人类健康与生命的大敌，夺去过千百万人的生命，给人类造成巨大的灾难。但人类一直在与传染病进行着长期不懈的斗争，并在二十世纪中期消灭了天花，许多传染病受到了控制。然而，进入二十世纪70年代以来，在人类传染病防治方面又出现了许多新情况，主要表现在一是一些被控制的传染病又死灰复燃、卷土重来，如霍乱、结核等，重新对人类健康构成了威胁；二是一系列新传染病相继出现或被发现，其中一些已经给人类带来了巨大灾难和恐慌，如2003年流行的严重急性呼吸系统综合征(SARS)、2004年波及亚洲的禽流感，在非洲流行的埃博拉出血热、全世界流行的艾滋病等。有科学家预言21世纪是传染病多发的世纪。根据“控制传染源——切断传播途径——保护易感人群”的流行病防治原则，建立一套快速、准确、敏感的病原体直接检测方法，是实现早期及时地发现病原体，防止传染病流行的重要环节，这对尚无疫苗保护的疾病更为重要。
但在实际检测中经常遇到的情况是待检测样品中所含的杂菌数量很多，待检测的致病微生物(细菌或病毒)含量相对较低，同时待检测样品本身(如食品、血液、分泌物、排泄物等)或其中所含有的杂质成分也严重影响检测效果的灵敏度和准确性。
对于微量的病原微生物，其传统的检测方法是需要对样品中的目的微生物进行培养、扩增。由于扩增过程复杂，所以费时费力。而免疫学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)；分子生物学方法，如PCR技术、基因芯片技术等，虽然提高了检测的敏感性、具有检测的特异性，但这些技术受限于样本的前增菌和靶细菌或病毒的分离过程。因此，如何从复杂背景中快速分离、纯化、浓集出目的微生物，一直是制约检测与诊断效率的“瓶颈”，所以必须采取有效的分离、浓集措施来充分提高目的微生物的浓度。
蛋白质的检测在生物医学诊断中具有重要意义，而常规的酶联免疫吸附试验(ELISA)技术、仪器检测技术等的敏感度一般为pM～mM水平，待检样品中的杂质往往对检测结果有明显影响。所以，也需要对待检样品中的目的蛋白进行分离纯化。
此外，反映体内多种功能指标的细胞和生物大分子，包括各种免疫细胞、肿瘤细胞、细胞因子等检测对疾病的早期诊断、治疗及预后判断等具有重要意义。现在在分离这些生物大分子时多采用微米级磁颗粒。
磁颗粒可以作为生物大分子的载体，抗体包被的磁颗粒称为免疫磁颗粒，由于其既有结合抗原的特性又有磁性的特点，因此，在从复杂样品中分离、纯化与浓集目的微生物、细胞和生物大分子等方面具有较多优势，包括快速(5～20分钟)、特异性强、操作简便、使用范围广(几乎可用于所有样品的处理)等。在医学上较早即被用于微生物、细胞和生物大分子的分离与浓集，以及致病菌及致病病毒等的分离。但常规微米级免疫磁颗粒的分离效率不高，颗粒间相互作用较强、分散性较差。
纳米材料是20世纪90年代后得到迅猛发展的新材料。纳米磁材料(粒径小于10nm～100nm)在磁结构和磁性方面与一般磁颗粒有很大区别纳米磁性颗粒，单位体积颗粒数目更多，比表面积更大；具有超顺磁性，磁相互作用很弱；它可在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成份得以分离、浓集或纯化等。
目前，尚无纳米免疫磁颗粒及制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种纳米免疫磁颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法。
本发明的第四个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法。
本发明的第五个目的是提供一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法。
本发明的技术方案概述如下一种纳米免疫磁颗粒，在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖，所述葡聚糖与特异性抗体联接，所述纳米免疫磁颗粒用下述方法制成(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备；(2)纳米免疫磁颗粒的制备。
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，由下列步骤组成(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10～20份与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2～6份混合，在氮气氛下，滴加至10～30份重量/体积百分比为30％～70％的葡聚糖T-40溶液中，混合，50～70℃，水浴10～30分钟，在剧烈搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35～45份，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0～8.0；③将悬液中的聚集体在离心力为600×g，离心10～20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 6～8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0份，加入10～30mmol/L NaIO4溶液0.1～0.5份，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时，加入1～3mol/L乙二醇0.1～0.3份终止氧化，用0.005-0.02mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析18～48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml，所述份数为体积份；(2)纳米免疫磁颗粒的制备向浓度为3～8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4溶液还原，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，10～60分钟，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，优选的是(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合，在氮气氛下，滴加至20份重量/体积百分比为50％葡聚糖T-40溶液中，混合，60℃水浴15分钟，在剧烈搅拌下，15分钟内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40份，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；②将悬液用乙酸调至pH为7.0；③将悬液中的聚集体在600×g，离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与-葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml，所述份数为体积份；(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置8小时，加入0.5mol/LNaBH4溶液还原，加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，30分钟，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一，或沙眼衣原体抗体、支原体抗体，梅毒螺旋体特异性抗体之一。
所述抗体还可以是甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、艾滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
所述抗体也可以是隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体，巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体，类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之一。
一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法，由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应靶细菌分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应靶病毒分离。
一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法，由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求6制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10～20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
本发明的纳米免疫磁颗粒是以Fe3O4为核心，外面包裹葡聚糖，葡聚糖通过功能基团与特异性抗体连接。该颗粒制备方法简单，葡聚糖作为包被材料，使得颗粒具有良好的分散性和悬浮稳定性，在蛋白质连接反应和细菌分离过程中不会聚集；而且该成分对被检测物无任何毒性，被分离物的生物学性状和功能不受影响，处于亚致死状态的微生物也能被回收，减少了假阴性的发生。在微生物和生物大分子的实际分离应用中，纳米免疫磁颗粒具有快速、高效、特异性分离、纯化、浓集目的微生物和生物大分子的特点。与快速检测技术相结合，可以实现致病微生物及生物大分子的快速检测与诊断。与常规微米级免疫磁颗粒的分离效率比，由于颗粒间相互作用较弱，分散性较好。
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16ml与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4ml混合，在氮气氛下，滴加至20ml 50％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液60℃水浴15分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加5mol/L的氨水40ml，15分钟滴完，温度仍保持60℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；②生成的悬液用乙酸调至pH为7.0；③将悬液中的聚集体经600×g离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；④取葡聚糖纳米磁颗粒1ml，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25ml，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2ml终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml；
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗致病性大肠杆菌抗体，混匀后，4℃避光放置8小时，再用0.5mol/LNaBH4溶液还原30分钟，加入NaBH4的量为0.3ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用SephacrylS-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
图1为本发明采用TECNAI-20透射电子显微镜拍得的葡聚糖纳米磁颗粒电镜照片，放大倍数×100000。照片显示葡聚糖纳米磁颗粒核心大小为5～10nm。
实施例2(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将0.5mol/L FeCl3·6H2O溶液12ml与1.4mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合，在氮气氛下，滴加至15ml 30％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液70℃水浴10分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加3mol/L的氨水30ml，10分钟滴完，温度仍保持70℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；②生成的悬液用稀盐酸调至pH为6.0；③将悬液中的聚集体经600×g离心10分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5mg/ml；④取葡聚糖纳米磁颗粒0.5ml，加入10mmol/L NaIO4溶液0.5ml，150转/分钟避光阻氧震荡0.5小时后，加入1mol/L乙二醇0.3ml终止氧化，用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析18小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3mg/ml；(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的甲型肝炎病毒抗体，混匀后，4℃避光放置6小时，再用0.2mol/LNaBH4溶液还原10分钟，加入NaBH4的量为0.1ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例3(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液3ml混合，在氮气氛下，滴加至13ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水26ml，30分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；②生成的悬液用稀盐酸调至pH为8.0；③将悬液中的聚集体经600×g离心20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，收集的颗粒冷冻干燥，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为10mg/ml；④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml，加入30mmol/L NaIO4溶液0.4ml，150转/分钟避光阻氧震荡12小时后，加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的隐孢子虫抗体，混匀后，4℃避光放置24小时，再用1mol/LNaBH4溶液还原60分钟，加入NaBH4的量为0.5ml/ml磁颗粒悬液，使生成物具有稳定结构，多余的抗体用Sephacryl S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
实施例4(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液10ml与0.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合，在氮气氛下，滴加至10ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水35ml，10分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；(其余同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的沙门氏菌属抗体，(其余同实施例1)。
实施例5(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将1.2mol/L FeCl3·6H2O溶液20ml与2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液6ml混合，在氮气氛下，滴加至30ml 70％(w/v)葡聚糖T-40溶液中，将此混合液50℃水浴30分钟后，在剧烈搅拌下，向混合液中滴加7mol/L的氨水45ml，30分钟滴完，温度仍保持50℃，并始终通氮气防止氧化，制成悬液；(其余同实施例1)。
(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的志贺氏菌属抗体，(其余同实施例1)。
实施例6(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①②③(同实施例1)，④取葡聚糖纳米磁颗粒2.0ml，加入30mmol/L NaIO4溶液0.1ml，150转/分钟避光阻氧震荡12小时后，加入3mol/L乙二醇0.1ml终止氧化，用0.02mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)4℃透析48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的金黄色葡萄球菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例7(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的嗜肺军团杆菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例8(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的霍乱弧菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例9(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的副溶血弧菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例10(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例12(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例2)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入15μg/mg颗粒量的单核细胞增生李斯特氏菌抗体，(其余同实施例2)。
实施例13(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例2)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的结核分枝杆菌抗体，(其余同实施例2)。
实施例14(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例3)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入30μg/mg颗粒量的变形杆菌抗体，(其余同实施例3)。
实施例15(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的腊样芽孢杆菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例16(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的淋球菌抗体，(其余同实施例1)。
实施例17(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10μg/mg颗粒量的沙眼衣原体抗体，(其余同实施例1)。
实施例18(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的支原体抗体，(其余同实施例1)。
实施例19(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入20μg/mg颗粒量的梅毒螺旋体特异性抗体，(其余同实施例1)。
实施例20(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的丙型肝炎病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例21(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的爱滋病病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例22(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单纯疱疹病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例23(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的脊髓灰质炎病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例24(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的柯萨奇病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例25(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的埃可病毒抗体，(其余同实施例1)。
实施例26(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的乙型肝炎表面抗原的抗体，(其余同实施例1)。
实施例27(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蓝氏贾第边毛虫抗体，(其余同实施例1)。
实施例28(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的蛔虫抗体，(其余同实施例1)。
实施例29(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨噬细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例30(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的巨核细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例31(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的淋巴细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例32(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的单核细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例33(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的各种肿瘤细胞抗体，(其余同实施例1)。
实施例34(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的类风湿因子抗体，(其余同实施例1)。
实施例35(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的p53抗体，(其余同实施例1)。
实施例36(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的甲胎蛋白抗体，(其余同实施例1)。
实施例37(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的癌胚抗原抗体，(其余同实施例1)。
实施例38(1)。葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的白介素-2抗体，(其余同实施例1)。
实施例39(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备(同实施例1)(2)纳米免疫磁性颗粒的制备向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入25μg/mg颗粒量的表皮细胞生长因子特异性抗体，(其余同实施例1)。
实施例40一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法，在1ml检测样本中，加入实施例1制备的纳米免疫磁性颗粒悬液5μl孵育30分钟，磁板吸引10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％的吐温-20的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在15分钟内使相应的致病性大肠杆菌分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例41一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，在1ml检测样本中，加入实施例2制备的纳米免疫磁性颗粒悬液20μl孵育5分钟，磁板吸引2分钟，弃上清后用含体积百分比为0.1％的吐温-20的0.005mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10分钟内使相应甲型肝炎病毒分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例42一种纳米免疫磁颗粒分离生物大分子的方法，在1ml检测样本中，加入实施例3制备的纳米免疫磁性颗粒悬液2μl孵育20分钟，磁板吸引5分钟，弃上清后用含体积百分比为0.08％的吐温-20的0.008mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在20分钟内使相应隐孢子虫分离。用此方法，加入不同的实施例制成的纳米免疫磁性颗粒，可以分别分离特异的细菌、病毒、寄生虫、细胞或生物大分子。
实施例43实验结果1.葡聚糖纳米磁颗粒及纳米免疫磁颗粒的性质葡聚糖纳米磁颗粒为黑色的悬液。颗粒近似球形，粒径为40-60nm，核心为5nm。在生理缓冲液中保持稳定，在pH4-10溶液中不会聚集沉降。在磁场作用下颗粒迅速聚集，而不存在静磁场时颗粒没有磁矩，即具有超顺磁性。经氧化和抗体连接后，所制得的纳米免疫磁颗粒与葡聚糖纳米磁颗粒性质基本相同，为棕色悬液。
2.敏感性和特异性当靶分子(应用时分别以致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、军团杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌、副溶血弧菌、腊样芽孢杆菌、霍乱弧菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，隐孢子虫，T淋巴细胞，肿瘤细胞、白介素-2等为靶分子)在水或磷酸盐缓冲液中稀释至102CFU/ml(克隆形成单位)或102PFU/ml(噬斑形成单位)或1pM时，回收率仍保持在90％以上。进一步实验证实，即使样品中只含有10个待检测的微生物或0.5pM的细胞因子，颗粒仍可捕获7-8个微生物或检出细胞因子。在杂菌数量为108CFU/ml或杂蛋白1μM时，敏感性为101-102CFU/ml或PFU/ml或1pM。特异性实验表明，该磁性纳米颗粒具有较强的特异性，未见交叉反应和非特异结合。
实施例44实际应用将10克不同食品(米饭、蔬菜、肉制品、牛奶、饮料，固体样本切碎)装入250ml三角烧瓶中，加入90ml灭菌生理盐水，再加入1ml靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml)。37℃富集培养0.5-8小时，每隔半小时取出样本，静置2分钟后，吸取1ml上清液按实施例40或实施例41或实施例42的方法进行检测，实验结果表明，即使在杂菌数量超过108CFU/ml下，经2.5小时富集后(牛奶需要4小时)，靶微生物便可从食品样本中被分离、检测出来，比常规分离(先经营养肉汤富集18-24小时，再经选择性培养基富集18-24小时)短得多。各种食物(成份)对免疫磁性分离没有大的干扰。
实施例45取100ml河水、湖水、自来水、纯净水或污水样本，在其中加入靶微生物(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，一种或一种以上)，使其终浓度在101CFU/ml或PFU/ml。取1ml样本，不必富集，直接加入制备的上述免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后洗涤一次，在短时间内(5～30分钟)可将靶细菌分离、检测出来。
实施例46取1ml或1g分泌物或排泄物(唾液、尿、粪便等)、血清样本或血液样本，10倍稀释后，加入0.1ml靶物质(致病性大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、金黄色葡萄球菌、嗜肺军团杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、结核分枝杆菌、变形杆菌、腊样芽孢杆菌、淋球菌，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、单纯疱疹病毒、髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、乙型肝炎表面抗原，沙眼衣原体和支原体，梅毒螺旋体，隐孢子虫，T淋巴细胞、单核细胞，各种肿瘤细胞，白介素-2，一种或一种以上)悬液(101CFU/ml或PFU/ml或1pM)。检测微生物时样品需37℃富集培养0.5-8小时，每隔半小时取出样本，静置2分钟后，吸取1ml上清液进行检测(即在1ml检测样本中加入制备的上述纳米免疫磁颗粒悬液2～20μl，孵育5～30分钟，磁板吸引2～10分钟，弃上清后洗涤一次，即可达到对靶细菌的分离目的)。非微生物样品不需要富集培养。结果表明，粪便、血清经2小时富集，唾液、尿液经4小时富集，可从样本中分离、检测出靶微生物。样品中的细胞和生物大分子也可以被检测出来。样品本身对免疫磁性分离效果没有明显干扰。
权利要求
1.一种纳米免疫磁颗粒，其特征是，在纳米级Fe3O4的表面包裹有葡聚糖，所述葡聚糖与特异性抗体联接，所述纳米免疫磁颗粒用下述方法制成(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备；(2)纳米免疫磁颗粒的制备。
2.一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征是由下列步骤组成(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备①将0.5～1.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液10～20份与0.5～2.5mol/L FeCl2·4H2O溶液2～6份混合，在氮气氛下，滴加至10～30份重量/体积百分比为30％～70％的葡聚糖T-40溶液中，混合，50～70℃，水浴10～30分钟，在剧烈搅拌下，10～30分钟内，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45份，温度保持50～70℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；②将悬液用乙酸或稀盐酸调至pH为6.0-8.0；③将悬液中的聚集体在离心力为600×g，离心10～20分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH6-8的0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为5～10mg/ml；④取步骤③制得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液0.5～2.0份，加入10～30mmol/L NaIO4溶液0.1～0.5份，150转/分钟避光阻氧震荡0.5～12小时，加入1～3mol/L乙二醇0.1～0.3份终止氧化，用0.005～0.02mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析18-48小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为3～8mg/ml，所述份数为体积份；(2)纳米免疫磁颗粒的制备向浓度为3～8mg/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入10～30μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置6～24小时，加入0.2～1mol/LNaBH4溶液还原，加入NaBH4的量为0.1～0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，10～60分钟，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
3.据权利要求2所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征是所述(1).葡聚糖纳米磁颗粒的制备为①将0.7mol/L FeCl3·6H2O溶液16份与1.6mol/L FeCl2·4H2O溶液4份混合，在氮气氛下，滴加至20份重量/体积百分比为50％葡聚糖T-40溶液中，混合，60℃水浴15分钟，在剧烈搅拌下，15分钟内，向混合液中滴加5mol/L的氨水40份，温度保持60℃，并始终通氮气，制成悬液，所述份数为体积份；②将悬液用乙酸调至pH为7.0；③将悬液中的聚集体在600×g，离心15分钟去除；游离的葡聚糖经聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与葡聚糖纳米磁颗粒分离，洗脱平衡液为pH7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为8mg/ml；④取步骤③制得葡聚糖纳米磁颗粒1份，加入25mmol/L NaIO4溶液0.25份，150转/分钟避光阻氧震荡6小时后，加入2mol/L乙二醇0.2份终止氧化，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液，4℃透析24小时，去除过量的NaIO4，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为6mg/ml，所述份数为体积份；(2).纳米免疫磁性颗粒的制备为向浓度为6mg/ml葡聚糖纳米磁性颗粒悬液中加入25μg/mg葡聚糖纳米磁颗粒量的抗体，混匀，4℃避光放置8小时，加入0.5mol/LNaBH4溶液还原，加入NaBH4的量为0.5ml/ml葡聚糖纳米磁颗粒悬液，30分钟，多余的抗体用聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝胶层析柱过滤与结合物分离。
4.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为抗致病性大肠杆菌抗体、沙门氏菌属抗体、志贺氏菌属抗体、金黄色葡萄球菌抗体、嗜肺军团杆菌抗体、霍乱弧菌抗体、副溶血弧菌抗体、小肠结肠炎耶尔森氏菌抗体、单核细胞增生李斯特氏菌抗体、结核分枝杆菌抗体、变形杆菌抗体、腊样芽孢杆菌抗体、淋球菌抗体之一，或沙眼衣原体抗体、支原体抗体，梅毒螺旋体特异性抗体之一。
5.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为甲型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、爱滋病病毒抗体、单纯疱疹病毒抗体、脊髓灰质炎病毒抗体、柯萨奇病毒抗体、埃可病毒抗体、乙型肝炎表面抗原的抗体之一。
6.根据权利要求2或3所述的一种纳米免疫磁颗粒的制备方法，其特征所述抗体为隐孢子虫抗体、蓝氏贾第边毛虫抗体、蛔虫抗体，巨噬细胞抗体、巨核细胞抗体、淋巴细胞抗体、单核细胞抗体、各种肿瘤细胞抗体，类风湿因子抗体、p53抗体、甲胎蛋白抗体、癌胚抗原抗体、白介素-2抗体、表皮细胞生长因子特异性抗体之一。
7.一种纳米免疫磁颗粒分离细菌的方法，其特征是由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求4制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应靶细菌分离。
8.一种纳米免疫磁颗粒分离病毒的方法，其特征是由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求5制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应靶病毒分离。
9.一种纳米免疫磁颗粒分离寄生虫、细胞和生物大分子的方法，其特征是由如下步骤组成在1ml检测样本中加入权利要求6制备的一种纳米免疫磁颗粒悬液2-20μl，孵育5-30分钟，磁板吸引2-10分钟，弃上清后用含体积百分比为0.05％～0.1％的吐温-20的0.005～0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤一次，在10-20分钟内使相应寄生虫、细胞和生物大分子分离。
全文摘要
本发明公开了一种纳米免疫磁颗粒、制备方法及应用，其纳米免疫磁颗粒是在纳米级Fe
文档编号G01N33/544GK1632582SQ20041009403
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者李君文, 段惠丽, 王新为, 金敏, 谌志强 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所