专利名称：中性粒细胞抗原底片的制备方法
技术领域：
本发明是关于中性粒细胞抗原底片的制备方法，该抗原底片用于抗中性粒细胞胞浆抗体的检测。
背景技术：
抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体，是近年来发展起来的一种用于诊断原发性小血管炎的极为重要的血清学诊断工具。原发性小血管炎主要指韦格纳肉芽肿(WG)、显微镜下多血管炎(MPA)和坏死性新月体肾小球肾炎(NCGN)，他们的发病与ANCA密切相关，因此临床上将上述疾病称为ANCA相关性血管炎。ANCA根据荧光染色模型的不同可分为cANCA和pANCA，目前的研究认为，cANCA多见于WG，而pANCA常与MPA和NCGN有关，他们都可以反映病情活动、协助诊断、指导治疗和判断复发，在血管炎性疾病的诊断和鉴别诊断中具有重要意义。近年来国外对ANCA及靶抗原的性质、疾病相关性、检测方法等方面进行了深入研究，ANCA已成为系统性血管炎及自身免疫性疾病重要的临床常规检测项目。
间接免疫荧光法是检测ANCA最早采用的方法，也是目前最常用、最受欢迎的初筛方法。但是这种方法首先需要具备质量优良的抗原底片，细胞的形态分布、胞浆成分的展示以及细胞的抗原活性，这些都直接影响着检测结果的准确与否。
目前所采用的中性粒细胞抗原底片制备方法主要是根据1988年哥本哈根第一届ANCA国际研讨会所制定的方法取正常人新鲜肝素抗凝血，加入3～4倍4℃预冷的红细胞溶解液，4℃放置5～10分钟，以1500rpm/min离心7～10分钟，弃上清；将细胞沉淀打匀后再加入4℃预冷的红细胞溶解液，放置5～10分钟，以1500rpm/min离心7～10分钟，弃上清；用4℃预冷的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，1500rpm/min离心7～10分钟，弃上清；加入含5％牛血清白蛋白的1640培养液，调整细胞数至2×106/ml；用细胞离心机甩片，1000rpm/min离心3分钟，将细胞甩至在玻片上呈单层均匀分布，自然风干后，4℃下用无水乙醇固定5分钟，风干后，-20℃保存，用于ANCA的检测。
在上述中性粒细胞抗原底片的制备过程中，细胞离心机甩片是一个关键的步骤，使用国产细胞离心机甩片后达不到预期的效果，制备的中性粒细胞抗原底片常因细胞呈皱缩状态，胞浆成分展示不充分而直接影响结果的观察，而进口细胞离心机价格又十分昂贵(约10余万元)，因此，目前使用的商品化中性粒细胞抗原底片多为进口产品，价格昂贵，检测成本太高，极大地制约了其在临床上的常规应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备成本低、检测结果准确、性能稳定，适合临床常规检测的中性粒细胞抗原底片的制备方法。
本发明的中性粒细胞抗原底片制备方法包括如下步骤取正常人新鲜肝素抗凝血，与1％甲基纤维素溶液按照4∶1的体积比混合，室温下沉降红细胞，保留白细胞血浆层；相同温度下，在试管中将等体积的Ficoll-Hypaque梯度剂I轻轻叠加在Ficoll-Hypaque梯度剂II上；将白细胞血浆层轻轻叠加在梯度剂的上层，平衡后置于水平式离心机内，1800～2000rpm/min离心20～25分钟；吸取中间中性粒细胞层，加入4℃预冷的缓冲液，10000～1200rpm/min离心5～10分钟，弃上清；
细胞沉淀中加入4℃预冷的0.1％～0.85％NaCl溶液，并调整中性粒细胞数至5×105/ml；细胞悬液加入清洁载波片上自然风干，4℃下无水乙醇固定5分钟，风干后密封。
其中，沉降红细胞的具体方法是将肝素抗凝血与甲基纤维素溶液混合，室温下斜置15～20分钟，使红细胞沉降；或者在室温下斜置5～10分钟，1000～1200rpm/min离心2～5分钟，使红细胞沉降。
所述的缓冲液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液。
与现在沿用的国际标准方法比较，本发明的中性粒细胞抗原底片制备方法具有以下优点。
首先，在中性粒细胞的分离上应用Ficoll-Hypaque不连续密度梯度一步分离法，获取了高浓度的中性粒细胞，废弃了以往需使用氯化铵或蒸馏水溶解红细胞而可能造成的对中性粒细胞的损伤。
其次，在将分离后的中性粒细胞沉淀洗涤后，加入适合浓度的NaCl溶液制成细胞悬液，使细胞在低渗状态下溶胀，形态饱满、胞浆展示充分，滴于载波片上呈单层均匀分布，从而解决了抗原底片细胞皱缩的问题，以利于结果的观察。
再次，在底片制备时没有使用细胞离心机进行甩片，而是将细胞溶胀后，调整细胞数直接滴于载波片上，解决了使用进口细胞离心机价格昂贵、而国产细胞离心机又达不到预期效果的问题，大大降低了底片制备的成本。
采用本发明方法制备的中性粒细胞抗原底片，自然风干后密封，分别保存于-20℃和-70℃，经实验观察，-20℃保存6个月，细胞片抗原性没有明显差异。-70℃保存一年，5份随机阳性标本检测结果没有差异。
使用本发明方法制备的中性粒细胞抗原底片，用间接免疫荧光法对325例原发性和继发性血管炎患者进行了ANCA检测，包括系统性血管炎58例分别为韦格纳肉芽肿(WG)6例、大动脉炎5例、白塞病22例、过敏性紫癜10例、其它未分类血管炎15例；继发性血管炎267例分别为肾小球疾病患者75例、系统性红斑狼疮(SLE)109例、类风湿关节炎(RA)83例。325例患者中，检出ANCA阳性36例，其中pANCA阳性29例，cANCA阳性7例，分别为WG组cANCA阳性5例，阳性率为83.33％(5/6)；其它系统性血管炎组pANCA阳性1例，阳性率为1.92％(1/52)；肾病组pANCA阳性2例，阳性率为2.67％(2/75)；RA组cANCA阳性1例，阳性率为1.2％(1/83)；SLE组pANCA阳性26例，cANCA阳性1例，阳性率为24.77％(27/109)。
同时，采用德国欧蒙公司提供的ANCA检测试剂，对325例患者中的ANCA阳性血清、6例WG患者血清及随机选取的部分SLE患者血清进行了复检及对照。全部ANCA阳性血清和6例WG患者血清的检测结果与本发明方法制备的中性粒细胞抗原底片检测结果完全相同，没有差异。只是在SLE组检测结果中，有4例与本发明制备的中性粒细胞抗原底片检测结果不同，其中1例本发明制备抗原底片pANCA阳性而欧蒙公司阴性，2例本发明制备抗原底片pANCA阴性而欧蒙公司阳性，但滴度不高，1例本发明制备抗原底片cANCA阳性而欧蒙公司阴性，检测结果略有差异。
将本发明制备的中性粒细胞抗原底片同国产抗原底片同时应用于临床常规检测，以进行对比。在检测的临床疑似血管炎患者604人中，使用本发明产品检出pANCA阳性66例、cANCA阳性10例，不典型ANCA阳性3例，阳性率分别为10.93％、1.66％和0.50％；而国产抗原底片产品检出pANCA阳性48例、cANCA阳性8例，阳性率分别为7.94％和1.32％。说明本发明制备的中性粒细胞抗原底片检出率明显高于国产抗原底片的检出率，且本发明制备的中性粒细胞抗原底片细胞形态饱满，胞浆成分展示充分，结果易于观察，完全可以满足临床需求。
具体实施例方式
实施例1取正常人新鲜肝素抗凝血，按照4∶1的体积比加入1％甲基纤维素，混匀后在室温下斜置20分钟，使红细胞沉降，收集富含白细胞的血浆层。
相同温度下，在试管中加入3ml比重为1.119的Ficoll-Hypaque梯度剂II，再将3ml比重为1.077的Ficoll-Hypaque梯度剂I轻轻叠加在梯度剂II的上面。
在梯度剂上层沿管壁轻轻叠加3～4ml白细胞血浆层，将试管平衡后置水平式离心机内，1800rpm/min离心25分钟，离心后可见液体明显分为3层，其中第1层为血浆-溶液I界面层，含有单核细胞和血小板，第2层为溶液-溶液界面层，含有中性粒细胞，第3层为沉淀层，含有红细胞。
将中间的中性粒细胞层吸出来，将细胞团轻轻打开，加入4℃预冷的pH＝7.4磷酸盐(PBS)缓冲液，用吸管轻轻吹打，使细胞充分混匀，1200rpm/min离心5分钟，弃上清。
用吸管将细胞团轻轻打开，在细胞沉淀中加入4℃预冷的0.3％NaCl溶液，制成细胞悬液，低渗状态下使细胞溶胀，并在显微镜下观察中性粒细胞的细胞形态，调整中性粒细胞数至5×105/ml。
将细胞悬液加入到清洁载波片上，每孔15μl，自然风干，4℃下用无水乙醇固定5分钟，风干后密封，标记抗原片制备时间，置-20℃保存备用。
实施例2取正常人新鲜肝素抗凝血，按照4∶1的体积比加入1％甲基纤维素，混匀后在室温下斜置5分钟后，1000rpm/min离心2.5分钟，使红细胞沉降，吸出富含白细胞的血浆层。
相同温度下，在试管中加入3ml Ficoll-Hypaque梯度剂II(比重1.119)，再将3ml Ficoll-Hypaque梯度剂I(比重1.077)轻轻叠加在梯度利II上。
在梯度剂上层沿管壁轻轻叠加3～4ml白细胞血浆层，将试管平衡后置水平式离心机内，2000rpm/mm离心20分钟，离心后可见液体明显分为3层，其中第1层为血浆-溶液I界面层，含有单核细胞和血小板，第2层为溶液-溶液界面层，含有中性粒细胞，第3层为沉淀层，含有红细胞。
吸取出中间的中性粒细胞层，用吸管将细胞团轻轻打开，加入4℃预冷的PBS缓冲液(pH 7.4)，用吸管轻轻吹打，使细胞充分混匀，1000rpm/min离心10分钟，弃上清。
用吸管将细胞团轻轻打开，于细胞沉淀中加入4℃预冷的0.6％NaCl溶液，制成细胞悬液，低渗状态下使细胞溶胀，并在显微镜下观察中性粒细胞的细胞形态，调整中性粒细胞数至5×105/ml。
将细胞悬液加入到清洁载波片上，每孔15μl，自然风干，4℃下用无水乙醇固定5分钟，风干后密封，标记抗原片制备时间，置-20℃保存备用。
权利要求
1.一种中性粒细胞抗原底片的制备方法，其特征是包括如下步骤取正常人新鲜肝素抗凝血，与1％甲基纤维素溶液按照4∶1的体积比混合，室温下沉降红细胞，保留白细胞血浆层；相同温度下，在试管中将等体积的Ficoll-Hypaque梯度剂I轻轻叠加在Ficoll-Hypaque梯度剂II上；将白细胞血浆层轻轻叠加在梯度剂的上层，平衡后置于水平式离心机内，1800～2000rpm/min离心20～25分钟；吸取中间中性粒细胞层，加入4℃预冷的缓冲液，1000～1200rpm/min离心5～10分钟，弃上清；细胞沉淀中加入4℃预冷的0.1％～0.85％NaCl溶液，并调整中性粒细胞数至5×105/ml；细胞悬液加入清洁载波片上自然风干，4℃下无水乙醇固定5分钟，风干后密封。
2.根据权利要求1所述的中性粒细胞抗原底片制备方法，其特征是所述的沉降红细胞是将肝素抗凝血与甲基纤维素溶液的混合液在室温下斜置15～20分钟，使红细胞沉降。
3.根据权利要求1所述的中性粒细胞抗原底片制备方法，其特征是所述的沉降红细胞是将肝素抗凝血与甲基纤维素溶液的混合液在室温下斜置5～10分钟，1000～1200rpm/min离心2～5分钟，使红细胞沉降。
4.根据权利要求1所述的中性粒细胞抗原底片制备方法，其特征是所述的缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明涉及抗中性粒细胞胞浆抗体检测用中性粒细胞抗原底片的制备方法，是将肝素抗凝血沉降红细胞、保留白细胞血浆层后，应用Ficoll－Hypaque梯度剂分离中性粒细胞，加入NaCl溶液制成细胞悬液，直接滴于载波片上制备中性粒细胞抗原底片。本发明制备的中性粒细胞抗原底片检出率明显高于国产抗原底片，与进口试剂检测结果没有差异，且抗原底片细胞呈单层均匀分布，形态饱满，胞浆成分展示充分，结果易于观察，可以满足临床需求。
文档编号G01N33/531GK1687780SQ20051001249
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月1日 优先权日2005年5月1日
发明者李小峰, 胡学芳, 吕志勤, 侯云霞, 张琳, 李雪飞, 赵春阳, 国华 申请人:李小峰