专利名称：葡萄球菌肠毒素快速检测试剂条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测食品及饮用水中葡萄球菌肠毒素的试剂条。
背景技术：
葡萄球菌肠毒素(SE)是金黄色葡萄球菌产生的一种毒性蛋白质，已报道有A，B，C，D，E，F(又称TSST-1)以及G，H，I等血清型。各型肠毒素均可引起食物中毒和院内感染。其中以A型最多见，B型和D型次之，葡萄球菌肠毒素是一种很强的促分裂原和超抗原，具有广泛的免疫调节作用，且其性质稳定，易于大量生产和制成气溶胶，已成为重要的生物战剂。目前对于葡萄球菌肠毒素的检测主要是在实验室中进行，即通过前增菌、选择性增菌、分离鉴定、动物试验等步骤最终得到检测结果。其整个过程需要10天左右，耗时费力，不能满足快速检测的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于食品中葡萄球菌肠毒素快速检测的试剂条。
本发明的目的是这样实现的葡萄球菌肠毒素快速检测试剂条，包括试剂、试剂条和微量移液管，由此形成能够快速检测葡萄球菌肠毒素的试剂条。
试剂所含的成分为细胞破碎液；所含的成分为标记的抗体或抗原以溶液形式保存，在检测前滴加到样品垫靠近层析膜一端。
试剂条上至少应载有20μL的特异性的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。
上述试剂可以通过下述方法获得1.免疫方法选6～8周，雌性BALB/c小鼠，以15mg/L SE加弗氏完全佐剂腹腔注射，然后分别以15μL，20μL加弗氏不完全佐剂腹腔注射加强免疫各1次，间隔2～3周，末次免疫后5天试血，以琼脂扩散方法测定抗SE，滴度达1∶8时可准备融合，融合前3天从尾静脉注入20mg/L SE。
2.细胞融合，筛选及克隆小鼠SP2/0骨髓瘤细胞复苏后按常规方法进行融合。脾细胞与骨髓瘤细胞的数量比约为5∶1，融合剂为50％聚乙二醇溶液，融合细胞用HAT培养基作选择性培养，第10～17天改用HT培养基，17天后改用普通的RPMI-1640培养基，待杂交瘤细胞明显生长后，取其上清以间接ELISA法筛选阳性克隆。对检出的阳性孔以有限稀释法进行克隆化3～4次，100％阳性后，扩大培养及冻存细胞株。
3.腹水制备采用常规法，在预先1星期注射石蜡油的BALB/C小鼠腹腔注射已建株的杂交瘤细胞约2×106CFU，10天后诱生腹水收集瓶离心腹水得上清。-20℃保存。
4.胶体金标记抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体复合物是这样制备的取0.01％四氯金酸水溶液200mL，加热至沸腾，加入8mL 1％柠檬酸三钠水溶液，煮沸5分钟，出现橙红色胶体金颗粒直径由电镜测定为200nm。取50mL胶体金一份，用0.1mol/L碳酸钟调PH至8.0，搅拌下将胶体金溶液分别与免疫亲和纯化的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇20000水溶液，使最终浓度为0.05％；将粗制品6000g离心45分钟，离心后，沉淀物生理盐水混悬至1.5mL，4℃保存；5.将按上述方法制备的胶体金标记的单克隆抗体分别喷撒在厚度1mm的三张玻璃纤维纸上，冻干密封保存。
本发明的特点是制成快速检测葡萄球菌肠毒素的检测试剂条，大大缩短了检测时间，其检测过程只需8分钟左右的时间，操作程序简单，使用方便。
具体实施例方式
实施例1 本发明的检测试剂条是由待测样品注入口、查看窗口和检测线、质控线组成。试剂条的支持物为硝酸纤维膜，其分为三个区域，两端分别为样品区和废液区，中部为实验反应区。实验反应区有两个带有试剂标记的条带，两条带上含有胶体金标记的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体，胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。上述三种试剂的使用量为100μL，浓度均为1∶100u。在各条带的标记完成后，用1％小牛血清白蛋白封闭硝酸纤维膜，最后用铝箔袋干燥封装。
实施例2 四种试剂的使用量为80μL，浓度均为1∶100u。其它内容均与实施例1的相同。
实施例3 四种试剂的使用量为90μL，浓度均为1∶120u。其它内容均与实施例1的相同。
实施例4 四种试剂的使用量为110μL，浓度均为1∶150u。其它内容均与实施例1的相同。
实施例5 四种试剂的使用量为120μL，浓度均为1∶180u。其它内容均与实施例1的相同。
使用本试剂条检测时，取100μL富集培养液加到试剂条上的长方形注入孔中，样品通过毛细管作用沿载体移动，如果样品中存在抗原则会结合到金标记抗体上形成抗原抗体复合物，并于检测线A区呈现一条红色带线，为阳性结果，余下的样品继续迁移到载体末端最终沉淀于废液池中。如样品中无待测抗原，则在检测线A区无任何色条出现，即为阴性结果.两种情况下，质控线B区皆出现红色带线，表示检测有效。如B区无带线，无论A区有无红色带线，都表示检测无效。
权利要求
1.葡萄球菌肠毒素快速检测试剂条，包括试剂、试剂条和微量移液管，由此形成能够快速检测葡萄球菌肠毒素的试剂条。
2.根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于试剂所含的成分为细胞破碎液；所含的成分为标记的抗体或抗原以溶液形式保存，在检测前滴加到样品垫靠近层析膜一端。
3.根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于试剂条上至少应载有20μL的特异性的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。
全文摘要
本发明的属于一种适用于食品中葡萄球菌肠毒素快速检测的试剂条。葡萄球菌肠毒素快速检测试剂条，包括试剂、试剂条和微量移液管，由此形成能够快速检测葡萄球菌肠毒素的试剂条。试剂所含的成分为细胞破碎液；所含的成分为标记的抗体或抗原以溶液形式保存，在检测前滴加到样品垫靠近层析膜一端。试剂条上至少应载有20μL的特异性的抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记抗葡萄球菌肠毒素单克隆抗体、胶体金标记的质控抗原以及相应质控抗原的抗体。本发明大大缩短了检测时间，其检测过程只需8分钟左右的时间，操作程序简单，使用方便。
文档编号G01N33/558GK1955739SQ20051004758
公开日2007年5月2日 申请日期2005年10月26日 优先权日2005年10月26日
发明者吴斌, 李晓岚, 秦成 申请人:吴斌, 李晓岚, 秦成