专利名称：一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种测定血清成分的试剂及制备方法，特别是测定血清中的低密度脂蛋白中胆固醇的试剂及制备方法，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。
背景技术：
血清(浆)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)与心脑血管疾病的发生率呈正相关已经流行病学和相关临床证实，检测低密度脂蛋白胆固醇还可广泛应用于相关的临床诊治，并作为脂类代谢异常的危险指标之一。
对低密度脂蛋白胆固醇的测定方法有已知的超速离心法和电泳法以及中华人民共和国卫生部医政司编制的《全国临床检验操作规程》(第二版281页)所推荐的Friedewald公式法和聚乙烯硫酸沉淀法。Friedewald公式法虽简便，但如果总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)中有一项测定不准或当甘油三酯大于4.52mmol/L时，采用该公式法计算LDL-C的结果是不准确的。聚乙烯硫酸沉淀法是用聚乙烯硫酸(PVP)选择性沉淀血清中的LDL-C，测定上清液中的胆固醇代表HDL-C和VLDL-C之和，用TC减去上清液胆固醇即得LDL-C的值。上述这些已知的方法由于都不能在全自动生化分析仪上直接检测，近几年，直接在全自动生化分析仪上进行检测的LDL-C试剂也相继出现，如日本专利6-242110公开了专门测定目标脂蛋白中胆固醇的方法，该方法是使目标脂蛋白以外的脂蛋白凝集，来控制与酶的反应，从而测定目标脂蛋白(LDL)，该方法在实现自动化方面是很有实用性的，但只能从除HDL外的脂蛋白中分级分离出的LDL，而不能从VLDL(极低密度脂蛋白)和CM(乳糜微粒)的混合物中定量和分级测定LDL，所以还是不能不借助分离手段测定LDL胆固醇。目前还有利用聚阴离子和二价金属盐复合物与非测量脂蛋白形成絮状复合物，从而进行测量脂蛋白的测定，但这些二价金属盐复合物检测完毕后，在全自动生化分析仪的排液管道中易与其他碱性试剂废液反应形成沉淀，堵塞管道，对全自动生化分析仪造成不良影响。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂及制备方法的改进，该试剂应具有检测简便准确、试剂性质稳定、适用各种型号的全自动生化分析仪的特点。
本发明提供的技术方案是一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂，包括适量缓冲液、稳定剂和色原，该试剂还包括以下成分A、高亲合性酶化合物，该酶化合物，由酶和活化物反应而得，其中活化物是甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种与活化剂混合、活化后获得，化合物的浓度为1-100毫克/毫升，化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20；所采用的酶是胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶二者摩尔比10∶1-1∶10；上述化合物与酶反应时的摩尔配比为1∶1-20∶1；B、表面活性剂，其加入比例为每升试剂10-50克，所述的表面活性剂是聚氧乙烯月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羟丙基磺酸钠、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚中的一种或任意比例混合的多种。
所述的缓冲液是GOOD’S缓冲液或磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液或柠檬酸缓冲液或硼酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-9，缓冲液的浓度是50-200mmol/L。
该试剂中还有适量催化剂、防腐剂和抗干扰物质。
所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法包括以下步骤一、化合物活化选择所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种，在水介质中用公知的叠氮法或碳化二亚胺法或丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20，温度0-25℃，PH在3-11范围内，时间0.1-24小时；二、酶溶解选择所述的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，溶解在缓冲液中；三、混合反应活化后的活化物与溶解后的酶溶液混合，该溶液在0-25℃的温度下反应18-24小时；四、配置反应后的酶化合物与表面活性剂混合，并加入缓冲液、稳定剂、用于显色测定的色原和催化剂。
所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素预先置于以下有机溶剂混合物中溶解二甲亚砜或甲酰替二甲胺或六甲醇与甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物；化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶30-1∶0.01。
该试剂中还加入防腐剂和抗干扰物质。
本发明所提供的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法及试剂，能够直接在各种型号的全自动生化分析仪上对低密度脂蛋白胆固醇进行检测，无需样本离心、沉淀等繁杂步骤，大幅度减轻了检测工作量、减少了检测时间、降低了检测成本；试剂的性质稳定在2-8℃可稳定12个月以上；而且特异性好，检测的准确率较高，与国家推荐的Friedewald公式法检测结果比较，相关性达到0.98以上。
图1至图3分别是本发明的实施例1至实施例3的测得值与《全国临床检验操作规程》(第二版279页)所推荐的Friedewald公式法计算所得值的相关性示意图。其中，各图中的纵坐标是Friedewald公式计算值，横坐标是各实施例的测得值。
具体实施例方式
经研究发现用经制备的高亲合性胆固醇酯酶化合物和高亲合性胆固醇氧化酶化合物以及只选择性对低密度脂蛋白胆固醇具有较强作用的表面活性剂配制的试剂用来测定经超速离心分离出的HDL、LDL、VLDL及CM各组份脂蛋白时，上述各组份脂蛋白胆固醇的反应性显示出不同。其反应性表现为LDL＞VLDL＞CM＞HDL。
当表面活性剂的浓度达一定时，HDL、VLDL、CM脂蛋白组分在很长时间内不参加测定LDL的反应。也就是在很长时间内只有LDL脂蛋白组份反应，因此本发明得到完成。
由此，本发明提供了一种低密度脂蛋白胆固醇的测定方法，其特征是样本中的低密度脂蛋白胆固醇在高亲合性胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶以及只选择性对低密度脂蛋白胆固醇作用的表面活性剂的作用下生成4-胆甾-3-烯酮和过氧化氢(H2O2)，H2O2在过氧化物酶作用下与4-氨基安替比林(4-APP)、酚类或苯胺类衍生物反应，生成有色的醌类化合物，利用比色分析原理即可在全自动生化分析仪上得出样本中LDL-C的含量。
为此，本发明提供的试剂及其制备方法是一、制备高亲合胆固醇酶化合物(一)选择酶和化合物该酶化合物，由酶和活化物制备而得，其中制备活化物的化合物选自甾类糖苷，该甾类糖苷在其结构中具有作为配基的呋甾烷醇或螺甾烷醇的甾环酶，以及具有含3-10个线状或分支结构单糖的低聚糖酶；或者选自三萜烯糖苷，该三萜烯糖苷在其结构中具有α-或β-胡椒烷、羊毛脂甾烷等的配基，以及具有由2-8个分支或线状结构基构成的低聚糖；或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的疏水蛋白质；或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的蛋白质毒素；或者选自能够有选择地与胆固醇形成复合物的多烯抗菌素，上述化合物可以单独使用也可以两种或几种混合使用，没有特别的限制，只要制得的酶化合物对低密度脂蛋白胆固醇的反应必比其它脂蛋白胆固醇的反应性强。
本发明中使用的甾类糖苷实例有天门冬苷、毛地黄皂苷、龙舌苷、羊毛蜡苷、脱糖毛地黄皂苷等等。
三萜烯糖苷的实例有七叶素、茶皂苷等。
疏水蛋白质实例有脂蛋白的脱水蛋白质、溶酶体的蛋白质等等。
蛋白质毒素可由细菌、海洋微生物等获得，作为实例有链球菌溶血素O、脑酮溶细胞素等。
多烯抗菌素实例有两性霉素B、菲律宾菌等。
为了提高检测的专一性，本发明中采用的酶是胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，当然也可以选用其它的酶，只要制得的酶化合物对低密度脂蛋白中胆固醇的反应必比其它脂蛋白胆固醇的反应性强。
(二)高亲合胆固醇酯酶化合物的制取将前述化合物中的一种或几种混合物在水介质中用公知的叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，选用的方法最好能够最大限度地保持制备的酶化合物的活性。众所周知，其中的活化剂，在叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法中分别是叠氮化物、对环己基-2-(4-吗啉)乙基-碳化二亚胺-甲基-对甲苯磺酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及高碘酸钠。化合物的浓度为1-100毫克/毫升。活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20，温度0-25℃，PH3-11，时间0.1-24小时；胆固醇酯酶溶解在PH＝5-9的缓冲液中，胆固醇酯酶与缓冲液的配比没有限定要求，只要胆固醇酯酶溶解充分即可；化合物与胆固醇酯酶的配比是1∶1-20∶1(摩尔比)；活化后的活化物与溶有胆固醇酯酶的缓冲液混合，该溶液在0-25℃的温度下反应18-24小时，为了提高胆固醇酯酶化合物的高亲合性，还可向溶液中加入能改变胆固醇酯酶化合物中的氨基的高分子聚合物。制备的酶化合物不需纯化，检测其活性后直接使用。
(三)高亲合胆固醇氧化酶化合物的制取胆固醇氧化酶溶解在PH＝5-9的缓冲液中，胆固醇氧化酶与缓冲液的配比没有限定要求，只要胆固醇氧化酶溶解充分即可；将前述化合物中的一种或几种混合物在水介质中用公知的叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，选用的方法最好能够最大限度地保持制备的酶化合物的活性。众所周知，其中的活化剂，在叠氮法、碳化二亚胺法、丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法中分别是叠氮化物、对环己基-2-(4-吗啉)乙基-碳化二亚胺-甲基-对甲苯磺酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及高碘酸钠。化合物的浓度为1-100毫克/毫升。活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20，温度0-25℃，PH3-11，时间0.1-24小时；化合物与胆固醇氧化酶的配比是1∶1-20∶1(摩尔比)，活化后的活化物与溶有胆固醇氧化酶的缓冲液混合，该溶液在0-25℃的温度下进行18-24小时，为了提高胆固醇氧化酶化合物的高亲合性，还可向溶液中加入能改变胆固醇氧化酶化合物中的氨基的高分子聚合物。制备的酶化合物不需纯化，检测其活性后直接使用。
上面所述的某些化合物，如甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素极少或不溶于水，为使它们完全溶解，可预先将它们溶解在以下不给出质子的极性有机溶剂中二甲亚砜、甲酰替二甲胺、六甲醇、甲酰替二甲胺与甲苯按2∶1混合的混合物、甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物。
以上高亲合胆固醇酯酶化合物和高亲合胆固醇氧化酶化合物是分别制备，也可先将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶混和后再制成酶化合物。
二、选用表面活性剂本发明所使用的对低密度脂蛋白胆固醇具有较强作用的表面活性剂，可以是聚氧乙烯月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羟丙基磺酸钠、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚等。表面活性剂可以单独使用也可以混合使用，其用量因具体成份而定，通常使用范围为每升试剂10-50克。
三、配置反应后的酶化合物与表面活性剂混合，并可酌情加入缓冲液、稳定剂、用于显色测定的色原和催化剂。
在本发明中为了保持酶化合物和试剂的稳定性，可以加入防腐剂、防霉剂或其它的醇类、高分子化合物，如乙二胺四乙酸二钠(EDTA.2Na)、血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、二价金属离子、乙二醇等。
在本发明中用于显色测定的色原可以是N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-2甲氧基苯胺(HDAOS)、TODP、TOOS等。
本发明所使用的缓冲液，可以是GOOD’S缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液等，缓冲液的种类和浓度因具体成份而定，这里不作限制，只要在PH为5-9的范围内保证较大的缓冲作用且不抑制酶活性的一种或几种。一般浓度可在50-200mmol/L，本发明优选100mmol/L的GOOD’S缓冲液。
本发明中为了防止其它非测量物质的干扰，可加入抗坏血酸氧化酶等抗干扰物质。
本发明在配置时所加入的缓冲液、防腐剂、稳定剂、色原和催化剂的数量根据需要确定，没有限定要求。
以上所述的所有的生化试剂、原料均可外购获得。
本发明所提供的试剂在全自动生化分析仪上测试时的主要调定参数如下
实施例1使用毛地黄皂苷化合物与酶制备的高亲合酶化合物和表面活性剂-壬基酚聚氧乙烯醚硫酸胺钠配制的试剂测定LDL胆固醇试剂I(R1)缓冲液MES(PH7.0) 100mmol/L稳定剂MgCL.6H2O2mmol/L色原 4-AAP 0.25mmol/L防腐剂NaN3 5mmol/L稳定剂BSA 0.5g/L催化剂胆酸钠20mmol/L高亲合性胆固醇酯酶化合物1500U/L高亲合性胆固醇氧化酶化合物 3000U/L抗干扰物质 抗坏血酸氧化酶 1000U/L表面活性剂 聚氧乙烯月桂基醚13g/L(当试剂I与试剂II混合时含量为10g/L)试剂II(R2)
缓冲液 MES(PH7.0) 100mmol/L稳定剂 BSA 0.5g/L防腐剂 NaN3 5mmol/L稳定剂 MgCL.6H2O 2mmol/L催化剂 辣根过氧化物酶950U/L色原TOPS 2mmol/L(其中制备高亲合性胆固醇酯酶化合物以及高亲合性胆固醇氧化酶化合物时毛地黄皂苷化合物的浓度为50毫克/毫升。活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶10，温度25℃，PH3，时间24小时；化合物与酶分别反应时的摩尔配比为1∶1)表1为本发明实施例1与Friedewald公式法的测定值对照表。
图1根据表1数据制成，本实施例1测得值与Friedewald公式法测得值的相关性r2为0.9901，说明相关性良好。
实施例2使用七叶素与酶制备的高亲合酶化合物和表面活性剂-烷基聚氧乙烯醚羟丙基磺酸钠配制的试剂测定LDL胆固醇试剂I(R1)缓冲液MOPS(PH6.7) 50mmol/L稳定剂EDTA.2Na 2mmol/L色原 4-AAP 0.20mmol/L防腐剂NaN3 5mmol/L稳定剂BSA0.5g/L催化剂胆酸钠 15mmol/L高亲合性胆固醇酯酶化合物 350U/L高亲合性胆固醇氧化酶化合物 3500U/L抗干扰物质 抗坏血酸氧化酶 1000U/L表面活性剂 烷基聚氧乙烯醚羟丙基磺酸钠 30g/L(当试剂I与试剂II混合时含量为
22.5g/L)试剂II(R2)缓冲液MOPS缓冲液(PH6.7)50mmol/L稳定剂BSA0.5g/L防腐剂NaN3 5mmol/L稳定剂MgCL.6H2O 2mmol/L催化剂辣根过氧化物酶 850U/L色原 TOPS 3mmol/L(其中制备高亲合性胆固醇酯酶化合物以及高亲合性胆固醇氧化酶化合物时七叶素化合物的浓度为1毫克/毫升。活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶20，温度10℃，PH6，时间10小时；化合物与酶分别反应时的摩尔配比为20∶1)表2为本发明实施例2与Friedewald公式法的测定值对照表。
图2根据表2数据制成，本实施例2测得值与Friedewald公式法测得值的相关性r2为0.9889，说明相关性良好。
实施例3使用脂蛋白的脱水蛋白质与酶制备的高亲合酶化合物和表面活性剂-聚氧乙烯高级醇醚配制的试剂测定LDL胆固醇。
试剂I(R1)缓冲液 PIPES(PH6.7)200mmol/L稳定剂 MgCL.6H2O 2mmol/L色原4-AAP 0.25mmol/L防腐剂 NaN3 5mmol/L稳定剂 BSA 0.5g/L催化物 胆酸钠20mmol/L
高亲合性胆固醇酯酶化合物 2600U/L高亲合性胆固醇氧化酶化合物260U/L抗干扰物质 抗坏血酸氧化酶1000U/L表面活性剂 聚氧乙烯高级醇醚 66g/L(当试剂I与试剂II混合时含量为50g/L)试剂II(R2)缓冲液 PIPES(PH6.7)200mmol/L稳定剂 BSA 0.5g/L防腐剂 NaN3 5mmol/L稳定剂 MgCL.6H2O 2mmol/L催化剂 辣根过氧化物酶1000U/L色原TOPS 2mmol/L(其中制备高亲合性胆固醇酯酶化合物以及高亲合性胆固醇氧化酶化合物时脱水蛋白质化合物的浓度为100毫克/毫升。活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶1，温度0℃，PH11，时间0.1小时；化合物与酶分别反应时的摩尔配比为10∶1)表3为本发明实施例3与Friedewald公式法的测定值对照表。
图3根据表3数据制成，本实施例3测得值与Friedewald公式法测得值的相关性r2为0.9814，说明相关性良好。
表1(本发明方法实施例1测定值与Friedewald公式计算法比较)
表2(本发明方法实施例2测定值与Friedewald公式计算法比较)
表3(本发明方法实施例3测定值与Friedewald公式计算法比较)
权利要求
1.一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂，包括适量缓冲液、稳定剂和色原，其特征在于该试剂还包括以下成分A、高亲合性酶化合物，该酶化合物，由酶和活化物反应而得，其中活化物是甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种与活化剂混合、活化后获得，化合物的浓度为1-100毫克/毫升，化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20；所采用的酶是胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶二者摩尔比是10∶1-1∶10；上述化合物与酶反应时的摩尔配比为1∶1-20∶1；B、表面活性剂，其加入比例为每升试剂10-50克，所述的表面活性剂是聚氧乙烯醚月桂基醚、多烷基酚聚氧乙烯月桂胺、烷基聚氧乙烯醚羟丙基磺酸钠、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚中的一种或任意比例混合的多种。
2.根据权利要求1所述的一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于所述的缓冲液是GOOD’S缓冲液或磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液或柠檬酸缓冲液或硼酸盐缓冲液，缓冲液的PH值为5-9，缓冲液的浓度是50-200mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂，其特征在于该试剂中还有适量催化剂、防腐剂和抗干扰物质。
4.根据权利要求1所述的一种测定低密度脂蛋白胆固醇试剂的制备方法，其特征在于所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法包括以下步骤一、化合物活化选择所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷、疏水蛋白质、蛋白质毒素和多烯抗菌素等化合物中的一种或任意比例混合的多种，在水介质中用公知的叠氮法或碳化二亚胺法或丁二酰亚胺法或高碘酸盐氧化法进行活化，活化条件为化合物与活化剂的摩尔比为1∶1-1∶20，温度0-25℃，PH在3-11范围内，时间0.1-24小时；二、酶溶解选择所述的胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，溶解在缓冲液中；三、混合反应活化后的活化物与溶解后的酶溶液混合，该溶液在0-25℃的温度下反应18-24小时；四、配置反应后的酶化合物与表面活性剂混合，并加入缓冲液、稳定剂、用于显色测定的色原和催化剂。
5.根据权利要求4所述的一种测定低密度脂蛋白胆固醇试剂的制备方法，其特征在于所述的甾类糖苷、三萜烯糖苷或多烯抗生素预先置于以下有机溶剂混合物中溶解二甲亚砜或甲酰替二甲胺或六甲醇与甲苯按2∶1混合的混合物，或者，甲酰替二甲胺与乙醇按2∶1混合的混合物；化合物与有机溶剂混合物的重量比例为1∶30-1∶0.01。
6.根据权利要求4或5所述的一种测定低密度脂蛋白胆固醇试剂的制备方法，其特征在于该试剂中还加入防腐剂和抗干扰物质。
全文摘要
本发明涉及一种测定血清中的低密度脂蛋白中胆固醇的试剂及制备方法。本发明的目的是提供一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂及制备方法的改进，该试剂应具有检测简便准确、试剂性质稳定、适用各种型号的全自动生化分析仪的特点。提供的技术方案是一种测定低密度脂蛋白胆固醇的试剂，包括适量缓冲液、稳定剂和色原，该试剂还包括以下成分A、高亲合性酶化合物；由酶和活化物反应而得；B、表面活性剂，其加入比例为每升试剂10－50克；该试剂中还有适量催化剂、防腐剂和抗干扰物质。所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法包括以下步骤一、化合物活化；二、酶溶解；三、混合反应；四、配置。该试剂中还加入防腐剂和抗干扰物质。
文档编号G01N21/31GK1696659SQ20051004991
公开日2005年11月16日 申请日期2005年6月1日 优先权日2005年6月1日
发明者王贤理, 蒙凯, 蔡其浩 申请人:王贤理